味连基因组DNA提取方法研究

余弦，王书林，林海霞，孙翠萍，王砚

DNA分子标记技术已广泛运用于中药的鉴定，高质量的DNA模板是进行PCR的重要前提，则DNA的提取是关键步骤。现在对中药DNA的提取主要利用新鲜植株进行提取，但从干燥药材中提取DNA的研究较少，因为中药材在其干燥、加工、贮藏等过程会造成DNA不同程度的降解。因此，如何从中药材中提取高质量的DNA模板是我们必须解决的问题。本课题在改良的CTAB法基础上对味连新鲜植株与干燥药材基因组总DNA提取方法进行了研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料及预处理

干燥药材均打成细粉。一部分味连植株新鲜叶片(1、5、9、13、17、21 号)用 dd H2O 清洗后经液氮急速冷冻，再转入－80℃超低温冰箱保存;另一部分新鲜叶片(2、6、10、14、18、22 号)经 dd H2O 清洗后，擦干，剪成碎片，置于装有干燥变色硅胶的密封袋里，充分摇匀，使之迅速干燥，放于干燥器中保存。实验材料采集地点及编号见表1。

表1 实验材料采集地点及编号

高庙镇七里村 21～22号 23～24号洪雅 —— 25～26号重庆石柱 —— 27～28号

1.2 仪器

1.5 mL、2 mL离心管、研钵、Eppendorf精密移液器、Eppendorf centrifu ge 5417R高速冷冻离心机、电泳装置、核酸－蛋白凝胶图像分析管理系统、岛津紫外分光光度仪、Innova U101超低温冰箱、UPT超纯水器、磁力搅拌器、高精度低温恒温槽、pH计、通风橱等。

1.3 试剂

2×CTAB 提取缓冲液［2%CTAB，100 mmol·L－1Tris－HCl(pH8.0)，20 mmol·L－1EDTA，1.4 mol·L－1NaCl，2%巯基乙醇］、TE 缓冲液［10 mmol·L－1Tris－HCl(pH8.0)，1 mmol·L－1EDTA(pH8.0)］、5×TBE 缓冲液(pH8.3)［445 mmol·L－1Tris 碱，445 mmol·L－1硼酸盐，1 mmol·L－1EDTA(pH8.0)］、6×凝胶上样缓冲液(0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油)、1.5%琼脂糖凝胶(琼脂糖1.5 g加至100 mL 0.5×TBE缓冲液中，加热溶解备用)、Mass RulerTMDNA Ladder Mix、溴化乙锭、氯仿、异戊醇、醋酸钠、无水乙醇、70%乙醇、dd H2O、液氮等。

1.4 方法

1.4.1 基因组总DNA的提取［1～3］

在2 mL离心管中加入65℃预热的500 μL CTAB提取缓冲液;味连叶片用液氮研磨成细粉后(约1 g)加入离心管中，或味连干燥药材细粉(约1 g)直接加入离心管中，小心混匀，于65℃水浴2 h，其间小心倒转离心管数次;冷却至室温后，加入500 μL氯仿－异戊醇(24:1)抽提，静置20 min分相，于10000 g 4℃离心10 min后取上清液;加入1/10体积3M NaAc(pH5.2)和2倍体积－20℃无水乙醇，－20℃过夜;用毛细管加热制成带“U”形钩状玻棒，将沉淀捞出;沉淀用1.5 mL 70%乙醇洗两次，4000 g短暂离心，倾去乙醇，沉淀室温晾干，溶于200 μL TE(pH8.0)缓冲液中，保存于－20℃。

1.4.2 紫外分光光度计检测

取DNA溶液稀释50倍，以TE溶液为空白溶液，用紫外分光光度法测定DNA在260 nm及280 nm处的吸光值，然后根据OD260/OD280比值判断DNA纯度，并根据DNA 260 nm检测其浓度。根据公式计算DNA样品的浓度:双链DNA溶液浓度(μg/μL)=OD260×稀释倍数×50/1000。

1.4.3 琼脂糖凝胶电泳检测

DNA样品中加入1/5体积的6×凝胶上样缓冲液，混匀后取8 μL样品在1.5%的琼脂糖凝胶(含0.5μL·mL－1的EB溶液染色)中进行电泳分离，同时要设立合适相对分子质量的DNA marker(Mass RulerTMDNA Ladder Mix)，以5 V/cm胶的电压电泳3 h。在凝胶成像系统下检测DNA的纯度及降解情况。

2 结果与分析

2.1 提取结果

在加入－20℃无水乙醇以后便出现白色絮状DNA沉淀，－20℃静置过夜后有利于沉淀。新鲜植株提取的DNA溶液无色透明，而干燥药材粉末提取的DNA溶液呈淡黄色，可能是由于药材中的小檗碱等成分溶出造成。

2.2 紫外分光光度计检测结果

如DNA样品的OD260/OD280比值大于1.8，说明仍存在RNA;OD260/OD280比值小于1.6，说明样品中存在蛋白质或酚。对味连提取的基因组总DNA进行紫外分光光度计检测结果见表2，表3。

表2 味连新鲜叶片DNA紫外分光光度计检测结果

表3 味连干燥药材DNA紫外分光光度计检测结果

由表2、表3可见，测得各样品溶液OD260/OD280的比值在1.6～1.8之间，说明 DNA纯度较高;根据DNA在260nm处测得的吸光值所计算出的DNA浓度也较高。

2.3 琼脂糖凝胶电泳检测结果

琼脂糖凝胶电泳后在100 bp处均呈现一条条带，说明从味连新鲜植株及干燥药材中均提出了DNA。比较图1A、B中条带的亮度及清晰度，可见从新鲜植株中提取的DNA条带亮度比从干燥药材中提取的亮，表示从新鲜植株中提取的DNA浓度较高;且个别干燥药材DNA(3、4、7号)的条带有晕染，揭示DNA有一定程度的降解。

图1 味连基因组DNA琼脂糖凝胶电泳结果

3 讨论

此方法能从味连新鲜植株与干燥药材中提取DNA，这就扩大了中药DNA的提取来源。从新鲜植株中提取的DNA浓度与纯度比干燥药材中提取的要高;从干燥药材中提取的DNA有一定程度的降解。但从味连干燥药材中提取的DNA能否满足PCR及后续扩增条件，有待于下一步研究。

［1］ 黄璐琦．分子生药学［M］．北京:北京大学医学出版社，2006．

［2］ 李晓波，冯波，张朝辉，等．植物药材总DNA提取［J］．中草药，2002，33(7):652．

［3］ 曹琳，刘忠权，郝明干，等．不同种类中药材的DNA提取方法［J］．中国现代应用药学，2004，21(6):465．