大孔吸附树脂分离纯化白术水煎液中白术内酯Ⅲ的工艺研究

李鸿翔，邓赟，彭腾，李伯群，贺钢民，贾波，杨菁

白术为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎，其含有的白术内酯Ⅲ据报道具有抑制子宫收缩[1]、抑制小鼠的胃肠运动[2]、促进脾虚大鼠胃肠道消化吸收功能[3]的药理作用，是白术中的有效成分之一，但是目前对白术水煎液中白术内酯Ⅲ的分离纯化工艺尚无报道。本实验通过对比6种大孔树脂的吸附和解吸附实验筛选出适合分离纯化白术水煎液中白术内酯Ⅲ的树脂，并优化了其工艺参数。

1 仪器与材料

SSI-series 1500高效液相色谱仪（美国科学系统公司），FA2004N电子天平(上海沪粤明科学仪器有限公司)色谱柱YMC-Pack ODS-AQ（250×4.6mmL.D S-5μm 12nm ）,ZTC-3、DM130、NKA-Ⅱ、AB-8、DA201、D101大孔树脂（天津海光化工有限公司），白术内酯Ⅲ>98%(自制)，甲醇（分析纯），白术（四川新荷花中药饮片有限公司，批号：0907034，产地：浙江）。

2 实验方法[4~6]

2.1 白术提取液的制备

用天平称取白术500g，加入10倍量水浸泡1h，自沸腾时起保持微沸1h，过滤，加入6倍量水条件同上煎煮1h，过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪回收溶液至2000mL，冷却后加入85%的乙醇至60%，静置24h，过滤除去多糖，回收溶液至1000mL。

2.2 含量测定

用高效液相色谱法测定提取液中白术内酯Ⅲ的含量，在1-50μg范围内线性关系良好，回归方程为y=1.4802x+10062（y为峰面积，x为浓度，R2=0.9998），色谱条件为：乙腈:水=55:45，波长：220nm，进样量：10μl，柱温为常温。

2.3 大孔树脂的筛选

2.3.1 大孔树脂的预处理 用95%的乙醇浸泡各类大孔树脂24h，然后用95%醇冲洗至洗脱液与蒸馏水1:1混合不浑浊为止，改用水洗至洗脱液无醇味，用水浸泡备用。

2.3.2 静态吸附量的考察 分别精密称取6种已处理好的湿大孔树脂约2g，置250mL具塞锥形瓶中，各加入浓度为3.64μg/mL的白术提取液50mL，将具塞锥形瓶放入恒温摇床25°C恒温振荡24h（80r/min）,充分吸附后，过滤，测定滤液（吸附液）中剩余白术内酯Ⅲ的浓度，计算吸附量。

2.3.3 解析率的考察 取过滤后的树脂，加蒸馏水50mL，于25°C恒温振荡120min，过滤。向上述树脂中加入50mL体积分数为90%的乙醇，室温下振荡（80r/min）解吸24h，至解吸平衡，过滤，测定滤液（解吸液）中白术内酯Ⅲ的浓度。计算解吸率。

2.3.4 大孔树脂对白术内酯Ⅲ的静态吸附动力学实验 根据上述实验筛选的结果，精密称取筛选的树脂约2g，装入250mL具塞试管磨口三角瓶中，加入浓度为6.10μg/mL的白术提取液50mL，25°C恒温振荡（80r/min）,每1h取1mL，测定白术内酯Ⅲ的浓度，绘制静态吸附动力学曲线。

2.4 大孔树脂对白术内酯Ⅲ的动态吸附与解吸附实验

2.4.1 吸附流速的影响 将3份浓度为4.35μg/mL的白术提取物3BV分别以1、2、3BV/h流速上样，待提取液全部通过树脂后，测定流出液中白术内酯Ⅲ的浓度，以流速为横坐标，流出液浓度为纵坐标做图。

2.4.2 上样浓度的影响 将4份不同浓度（50.26μg/mL、39.49μg/mL、16.52μg/mL、6.47μg/mL）的白术提取液3BV以2BV/h的流速进行上柱，收集流出液，测定流出液中白术内酯Ⅲ的浓度，以流出液中浓度为纵坐标，以浓度编号为横坐标作图。

2.4.3 最大上样量的确定 将选定大孔树脂湿法装柱后，以1BVmL/h的流速连续加入浓度为16.52μg/mL的白术提取液，每0.5BV收集为一份，测定流出液的白术内酯Ⅲ的含量，以流出液体积为横坐标，以流出液中的浓度为纵坐标做图。

2.4.4 洗脱剂浓度的考察 将4根选定好的大孔树脂湿法装柱后，各加入3BV浓度为7.00μg/mL的白术提取液，吸附4h，分别用4BV蒸馏水、4BV30%、4BV50%、4BV70%的乙醇洗脱，流速为2BV/h，每1BV收集一份，测定白术内酯Ⅲ含量，以洗脱液体积为横坐标，洗脱液浓度为纵坐标画图。

2.4.5 洗脱流速的考察 将4根选定好的大孔树脂湿法装柱后，各加入3BV浓度为39.50μg/mL的白术提取液，吸附4h，以3BV70%乙醇为洗脱剂，不同的洗脱流速（1、2、3、4BV/h）进行解吸，以洗脱流速为横坐标，洗脱液中白术内酯Ⅲ的浓度为纵坐标作图。

2.4.6 洗脱曲线的考察 将浓度为14.52μg/mL的白术提取液按照上述确定的吸附和洗脱条件，进行上柱、吸附和洗脱，以每1BV为一份，连续接取。对洗出馏分进行检测，以流出液体积为横坐标，以每份流出液中白术内酯Ⅲ的浓度为纵坐标作图绘制洗脱曲线。

3.结果与讨论

3.1 大孔树脂对白术内酯Ⅲ的静态吸附实验

3.1.1 大孔树脂对白术内酯Ⅲ的吸附量和解吸率的考察 不同种类型大孔树脂对白术内酯Ⅲ的吸附量和解吸率见表1。由表1可知AB-8对白术内酯Ⅲ有较大的吸附量和比较高的解吸率，因此选择AB-8大孔树脂做进一步实验。

表1 不同大孔树脂的吸附量与解析率

3.1.2 大孔树脂对白术内酯Ⅲ的静态吸附动力学实验

评价大孔树脂不仅要考虑吸附量和解析率还要考虑其吸附速率，AB-8对白术内酯Ⅲ吸附动力学实验结果见图1。

从图中可以看出AB-8大孔树脂对白术内酯Ⅲ吸附开始阶段变化较快，4h以后基本达到平衡状态。

3.2 大孔树脂对白术内酯Ⅲ的静态吸附动力学实验

3.2.1 吸附流速的影响 （见图2）。

从图2可以看出随着吸附流速的增大流出液中白术内酯Ⅲ的含量也增大，可能是因为没有和大孔树脂充分接触而流出，考虑到工作效率选择大孔树脂的吸附流速为2BV/h。

3.2.2 上样浓度的影响 （见图3）。

从左到右上柱提取液浓度分别为50.26μg/mL，39.49μg/mL，16.52μg/mL，6.47μg/mL。

从图3可以看出上样浓度越高洗脱液中白术内酯Ⅲ的含量也越高，结合工作效率选择40μg/mL左右的浓度为上样浓度。

3.2.3 最大上样量的确定 （见图4）。

从图4中可以看出在此浓度下上样体积在8BV以前流出液中白术内酯Ⅲ的变化不大，在9BV的时候白术内酯Ⅲ开始出现泄漏，所以此浓度下白术提取液的上样体积为9BV左右。

3.2.4 洗脱剂浓度的考察 （见图5）。

从图中可以看出水和30%左右的乙醇洗脱液中基本不含有白术内酯Ⅲ，50%左右的乙醇中有少量白术内酯Ⅲ但不能全部洗出，所以我们选择用30%左右的乙醇3BV洗脱提取液中的杂质，然后选用70%的乙醇继续进行洗脱。

3.2.5 洗脱流速的考察 （见图6）。

由图6可知随着洗脱流速的增大流出液中白术内酯Ⅲ的含量减小，考虑到工作效率我们选择2BV/h的流速为洗脱流速。

3.2.6 洗脱曲线的考察 （见图7）。

从图7可以看出当洗脱体积为9BV时洗脱液中白术内酯Ⅲ的含量已经很小，所以我们选择9BV的洗脱剂进行洗脱。

4 讨论

4.1 白术是一种常用药材，目前尚无确切的质量标准，白术内酯Ⅲ做为白术中一种有效成分，用来评价白术提取物优劣较为恰当。本工艺对白术提取物纯化工艺进行研究，确定了白术提取物的最佳纯化工艺，为白术内酯Ⅲ的分离纯化提供了理论基础。

4.2 由于白术内酯Ⅲ的最大吸收波长为220nm，所以我们选择220nm的波长为测量波长，考察了甲醇:水、乙腈:水的不同比例，结果以乙腈和水在55:45的条件下和其他峰的分离度良好，所以我们选择流动相的比例为乙腈:水=55:45。

[1] ZhangYQ,XμSB,LinYC,et al.Antagonistic effects of 3 sesqμiterpene lactones from Atractylodesmacrocephala Koidz on rat μterine contraction in vitro[J].Acta Pharmacol sinica,2000,21(1):91.

[2] 张奕强,许实波,林永成.白术内酯系列物的胃肠抑制作用[J].中药材,1999,22(12):636.

[3] 郝延军,桑育黎.白术内酯Ⅰ、Ⅲ对脾虚大鼠胃肠道消化吸收的影响[C].中华中医药学会第五届中药炮制分会学术会议论文集,2005:215.

[4] 李洪洋,文连奎.大孔树脂分离纯化五味子醇甲的研究[J].食品与机械,2011,27(3):56.

[5] 周洪伟,许文博.赤芍总苷提取与大孔树脂纯化工艺研究[J].中医药学报,2011,39(1):48.

[6] 张影,罗佳波.双黄连酚针中连翘用大孔树脂精制的工艺研究[J].中医药信息,2011,28(3):75.