夏天无总生物碱渗透泵控释片中总生物碱的纯化工艺研究

李杰，尹蓉莉，李东芬，吕懿平，赵明琴

夏天无系罂粟科植物伏生紫堇Corydalis decumbens（Thunb.）Pers.的干燥块茎，具活血止痛、舒经活络、祛风除湿等功效。主治高血压、脑血管引起的中风偏瘫，并对风湿性关节炎、坐骨神经痛、小儿麻痹后遗症等有较好的作用，其主要活性成分为生物碱类。将夏天无总生物碱制成渗透泵控释制剂可以减少服用次数，增加病人适应性，减少药物在体内的峰谷现象，同时提高药物的安全性、有效性、适应性和可控性。本实验旨在优选出一种适合分离纯化夏天无总生物碱的大孔树脂，并对优选出的大孔树脂分离夏天无总生物碱时的工艺条件及参数进行研究，实验结果表明筛选出的工艺简单可行，能够满足夏天无总生物碱渗透泵控释片制剂的生产需求。

1 实验仪器与材料

RE-53C旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-DIII型循环水式真空泵 (浙江黄岩求精真空泵厂)；79HW-1恒温磁力搅拌器(江苏金坛市金城国胜实验仪器厂)；BP61型电子分析天平(上海精科仪器厂)；电热恒温水浴锅（上海医疗器械七厂）；UV1100紫外/可见分光光度仪（上海天美）；DL-720D 数控超声波清洗器（上海之信仪器有限公司）；F-160型粉碎机（北京光明医疗仪器厂）：夏天无药材（亳州市安东药业有限责任公司）、原阿片碱对照品(110853-200201)由中国药品生物制品检定所提供；95%乙醇、浓盐酸、氯仿、溴甲酚紫、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠（成都市科龙化工试剂厂）；D101、AB-8、HPD722、HPD400、X-5型大孔吸附树脂（沧州宝恩化工有限公司）。

2 方法与结果

2.1 夏天无总生物碱含量测定方法[1]

酸性染料比色法：酸水溶解样品，以溴甲酚紫作离子对，用磷酸盐缓冲液作水相，氯仿为有机相提取夏天无总生物碱与溴甲酚紫形成的呈色离子对，以原阿片碱为对照品，比色法测定夏天无总生物碱。

2.2 夏天无提取液的制备

将夏天无药材粗粉1 kg，用1%HCl 溶液10 L作为溶剂，充分浸渍48 h后，进行渗漉操作，得到总碱提取液。

2.3 大孔树脂预处理

将大孔树脂用95%的乙醇浸泡24 h，使其充分膨胀，湿法装柱，然后用95%的乙醇液洗至流出液加适量纯水无白色浑浊现象，再用去离子水洗净乙醇，直至流出液无浑浊为止。

2.4 树脂型号的筛选

取过量夏天无提取液5份各150 mL，置具塞锥形瓶中，分别加入5种型号的大孔树脂(D101、AB-8、X-5、HPD722、HPD400)各3 g，每10 min振摇一次，振摇2 h，静置过夜，使达饱和吸附。过滤大孔树脂，分别取各树脂吸附后的溶液测定总生物碱的含量。再取吸附饱和的树脂，分别加入95%乙醇，振摇2 h，静置过夜，滤过，分别测定滤液中总生物碱的含量。计算夏天无总生物碱的提取率（解析后所得的总生物碱量与原提取液中总生物碱量的比值）。实验结果见表1。

表1 5种大孔树脂对夏天无总生物碱的提取率

由上述试验结果可知，HPD722型大孔树脂分离纯化夏天无总生物碱提取率较高，故确定选用HPD722型大孔树脂。

2.5 最大上样量的考察

将处理完毕的HPD722湿树脂装柱，使树脂柱的径高比约为1∶8（r=1.5cm，V=20ml），将渗漉液上样，收集流出液，分别测定每个床体积(Bed Volume,BV)流出液中总碱的浓度，绘制出总碱的泄漏曲线。结果见图1。

上述试验结果表明，总生物碱在第8份时出现较大泄漏，所以确定最大上样量为7倍柱体积。

2.6 上样流速考察

取5份经预处理的HPD722型湿树脂，按“2.5”项确定的方法上样，分别以1 BVh-1、2 BVh-1、3 BVh-1、4 BVh-1的流速上样，收集柱后液，测定7份柱后液中总生物碱的含量，计算总生物碱吸附量。结果见表2。

表2 总生物碱吸附量/mg

由结果可知，随着流速的增大，大孔树脂对总生物碱吸附量有减小的趋势，但1 BVh-1、2 BVh-1、3 BVh-1相差不大，为节省成本，确定上样流速为3 BVh-1。

2.7 杂质洗脱剂用量的考察

取3份经预处理的HPD722型湿树脂，按“2.5”和“2.6”项确定结果上样，分别用去离子水、0.2% 氨水以1 BVh-1进行洗脱，每1 BV接收1份，测定总生物碱的含量，同时观察洗脱液的颜色，确定洗脱剂的用量。结果见表3。

表3 两种杂质洗脱剂总生物碱含量/mgmL-1

表3 两种杂质洗脱剂总生物碱含量/mgmL-1

序号 1 2 3 4 5 6去离子水 0.847 1.044 1.166 1.077 0.989 0.910 0.2% 氨水 0 0 0 0 0 0

由结果可知，去离子水洗脱时有部分生物碱损失，而0.2%氨水能保证生物碱不被洗脱下来，所以选定0.2%氨水为杂质洗脱剂。通过观察去离子水洗脱到6个柱体积后，洗脱液颜色已较浅，水溶性杂质基本上已经洗掉，确定杂质洗脱剂用量为6个柱体积。

2.8 洗脱剂浓度及用量的选择

取3份经预处理的HPD722型湿树脂装柱，按“2.5”、“2.6”和“2.7”项确定结果上样并洗脱杂质，分别以55%乙醇、75%乙醇和95%乙醇洗脱吸附在树脂柱上的总生物碱，每1 BV接收1份，检测总生物碱的含量，以洗脱液中总生物碱含量为指标，确定乙醇浓度及用量。结果见表4。

表4 3种洗脱剂中总生物碱含量/mgmL-1

表4 3种洗脱剂中总生物碱含量/mgmL-1

序号 1 2 3 4 5 6 7 55%乙醇 3.934 1.313 2.136 0.431 0.347 0.288 0.263 75%乙醇 4.763 0.926 0.910 0.733 0.872 1.632 0.889 95%乙醇 4.077 4.813 2.359 0.750 0.300 0.032 0.000

由结果可知，洗脱6个柱体积时，95%乙醇总生物碱含量已经很低，55%乙醇和75%乙醇仍含有一定量总生物碱，考虑到成本，确定总生物碱洗脱剂为95%乙醇，洗脱体积为5个柱体积。

2.9 洗脱速度的考察

取经预处理的HPD722型湿树脂4份，按前几项下确定结果上样并洗脱杂质，用5倍柱体积的95%乙醇分别以0.5、1、1.5、2BVh-1的流速洗脱，收集洗脱液，测定其中总生物碱的含量，计算洗脱率。结果见表5。

2.1 0 纯化工艺验证

取夏天无粗粉3kg渗漉提取，取渗漉液平均分成3份，按最佳工艺经大孔树脂分离纯化，减压回收乙醇，真空干燥后得到总碱粉末。经测定，3份精制物中总生物碱含量分别达到：77.2%、74.8%、75.5%，说明工艺稳定可行。

3 结论

综上考察，5种大孔树脂中，HPD722最适合分离夏天无总生物碱，最佳工艺条件为：上样量为7BV；上样流速为3 BVh-1；0.2%氨水液6BV洗脱杂质；95%乙醇洗脱总生物碱，洗脱体积为5BV，洗脱速度为1 BVh-1。采用本实验确定的工艺，分离纯化后的总生物碱含量可达70%以上，满足夏天无总生物碱渗透泵控释片的制剂需求。

[1] 廖静,梁文藻.酸性染料比色法测定不同产地夏天无中总生物碱的含量[J].中草药,1993,24(7):354.

[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部) [S].北京:中国医药科技出版社,2010年.

[3] 赵大洲,戴胜军.大孔树脂分离夏天无总生物碱的研究[J].中成药,2006,28(2):182.