无溶剂体系中 Span修饰的猪胰脂酶催化茶油与亚油酸酯交换

曾 俊,杨国龙,毕艳兰,孙尚德,张 洁

(河南工业大学粮油食品学院,河南郑州 450052)

无溶剂体系中 Span修饰的猪胰脂酶催化茶油与亚油酸酯交换

曾 俊,杨国龙＊,毕艳兰,孙尚德,张 洁

(河南工业大学粮油食品学院,河南郑州 450052)

在无溶剂体系中以 Span20、Span80和 Span85修饰的猪胰脂酶 (Span20-PPL、Span80-PLL和 Span85-PPL)催化茶油与亚油酸进行酯交换,以酯交换量为考察指标,研究 Span20、Span80和 Span85与猪胰脂酶 (PPL)的相互作用对其催化油脂酯交换反应的影响.结果表明:30℃下,相同时间内 Span20-PPL、Span80-PPL和 Span85-PPL催化酯交换的交换量与 PPL催化酯交换的交换量稍小,24 h的酯交换量都在 4%～7.5%;50℃下,Span20-PPL、Span80-PPL和 Span85-PPL催化酯交换的交换量比 PPL催化酯交换的酯交换量高,24 h的酯交换量分别为 19.9%、22.4%、21.2%和 15.6%;70℃下,Span20-PPL、Span80-PPL和 Span85-PPL催化酯交换的交换量比 PPL催化酯交换的交换量低,24 h的酯交换量分别为23.7%、26.8%、22.3%和 31.5%.Span20、Span80和 Span85与 PPL的相互作用对其催化油脂酯交换结合量的影响与表面活性剂的类型和反应温度有关.

溶剂体系;Span修饰的猪胰脂酶;茶油;亚油酸;酯交换;酯交换量

0 前言

传统酶学研究认为只有在水溶液中酶才能保持催化活性,有机溶剂会使酶变性失活.进入 20世纪 80年代以来,随着酶反应研究的深入和扩展,人们注意到酶在非水相中也有催化活性[1],酶被应用于有机溶剂、多相体系、气相底物以及超临界流体等非水相体系中[2-5].在非水介质中,脂肪酶在医药、食品以及化工领域有着巨大的应用潜力,是有机合成中重要的生物催化剂,广泛应用于油脂、食品、香料、化妆品、医药、农药等有机合成领域中[6].随着研究的深入开展,人们开始关注到无溶剂体系下脂肪酶的催化反应.无溶剂体系具有如下优点:提高底物和产物浓度以及反应选择性,纯化过程容易、步骤少[7].吴华昌等[8]运用正交试验研究了在无溶剂系统中利用 1,3位置特异性脂肪酶催化 POMF与硬脂酸甲酯进行酯交换反应制取类可可脂.然而对于无溶剂体系中Span修饰的脂肪酶催化酯交换反应的报道和研究较少.作者采用 Span20-PPL、Span 80-PPL和Span85-PPL作为催化剂,在无溶剂体系中催化茶油和亚油酸的酯交换反应,以酯交换量为衡量指标考察 Span20、Span80和 Span85与猪胰脂酶的相互作用对其催化油脂酯交换反应的影响.

1 材料与方法

1.1 材料与设备

猪胰脂酶:Sigma公司;茶油:河南信阳长园野生茶油有限公司;亚油酸 (含量≥95%):安庆市中创工程公司赠送;Span表面活性剂:Sigma公司;正己烷为色谱纯,其余为分析纯.

Agilent6890N气相色谱仪:美国 Agilent公司;FOSS—2300型自动定氮仪:瑞典 Foss公司.

1.2 试验方法

1.2.1 Span修饰的脂肪酶的制备

将一定量的 Span溶解于乙醇的水溶液中,然后缓慢地加入一定量的猪胰脂酶,继续缓慢地搅拌一定时间,使猪胰脂酶完全溶解在混合体系中,然后在 3 500 r/min下离心 5 min,取沉淀,冷冻干燥成粉末状.

Span修饰猪胰脂酶的流程如图 1所示,反应条件见表1.0.5 mol/L甲醇钠溶液,室温下轻摇 5 min,然后加入少量无水硫酸钠,静置 1 h后,于 2 000～3 000 r/min离心 2～3 min,取上清液用于 GC分析[9].

原料茶油及酶催化反应产物甘三酯脂肪酸组成分析条件:色谱柱,BPX—70(30.0 m ×250μm×0.25μm,澳大利亚 SGE公司);进样口温度:230℃;柱温:180℃;检测器温度:300℃;氮气流速:1.5 mL/min.

图1 Span修饰猪胰脂酶的流程

2 结果与分析

表1 Span修饰猪胰脂酶的条件

2.1 修饰猪胰脂酶和未修饰酶中蛋白质含量

酶是在生物细胞里产生、以蛋白质为主要成分的生物催化剂,起催化作用的主要是其中的蛋白质.作者对修饰后的猪胰脂酶和未修饰酶中的蛋白质含量进行测定,结果见表2.

表2 原猪胰脂酶和修饰的猪胰_脂酶的蛋白质含量 %

原猪胰脂酶和 Span修饰的猪胰脂酶的蛋白质含量按 GB 5009.5-2010中的凯氏定氮法测定.

1.2.2 猪胰脂酶催化酯交换反应

将一定量的茶油与亚油酸 (亚油酸︰茶油 =2︰1,mol/mol)加入 50 mL烧瓶中,再将烧瓶置入磁力搅拌恒温水浴中,在合适的温度下搅拌 30 min后加入猪胰脂酶 (茶油质量的 15%,m/m),开始计时,每隔一定时间取样,分析产物中甘三酯的全样脂肪酸组成,计算酯交换过程中酯交换量.

酯交换量(%)=产物甘三酯中亚油酸的摩尔百分数 -原料茶油中亚油酸的摩尔百分数.

1.2.3 产物中甘三酯全样脂肪酸组成分析

将 0.5 mL反应产物溶解于 1.0 mL石油醚中,然后进行薄层层析 (吸附剂为硅胶 G,展开剂V石油醚︰V无水乙醚︰V甲酸=70︰30︰1),再将薄层板置于通风橱中晾干,并将 2,7-二氯荧光素均匀地喷在薄层板上,晾干后放于紫外分析仪上观察并刮下甘三酯谱带[9].

将从薄层板上刮下的甘三酯谱带 (甘三酯与硅胶的混合物)溶于 2.5 mL正己烷中,加入 1 mL

由表2可以看出,修饰后猪胰脂酶中蛋白质含量比原猪胰脂酶低,原酶的蛋白质含量在 90%以上,而 3种修饰后的猪胰脂酶的蛋白质含量在78%左右,这是因为修饰过程中酶蛋白与 Span间通过疏水或亲水相互作用进行结合会使修饰后酶的蛋白质含量降低.

2.2 无溶剂体系中 Span20修饰的猪胰脂酶催化茶油与亚油酸酯交换反应(图 2)

图2 Span20-PPL催化酯交换过程中酯交换量随时间的变化

由图 2可以看出,在无溶剂体系酶催化酯交换反应中,30℃下,相同时间内 Span20-PPL催化酯交换的交换量较 PPL催化酯交换的交换量略小,但没有太大差别,24 h的酯交换量都约为5%;50℃下,Span20-PPL催化酯交换的交换量比PPL催化酯交换的交换量高,24 h的酯交换量分别为 19.6%和 15.6%;70℃下,Span20-PPL催化酯交换的交换量比 PPL催化酯交换的交换量低得多,24 h的酯交换量分别为 23.7%和 31.5%.

2.3 无溶剂体系中 Span80修饰的猪胰脂酶催化茶油与亚油酸酯交换反应(图 3)

图3 Span80-PPL催化酯交换过程中酯交换量随时间的变化

由图 3可以看出,在无溶剂体系酶催化酯交换反应中,30℃下,相同时间内 Span80-PPL催化酯交换的交换量较 PPL催化酯交换的交换量稍小,24 h的酯交换量分别为 4.4%和 5.1%;50℃下,Span80-PPL催化酯交换的交换量比PPL催化酯交换的交换量高得多,随着反应时间的延长差别越来越明显,24 h的酯交换量分别为22.4%和 15.6%;70℃下,Span80-PPL催化酯交换的交换量比 PPL催化酯交换的交换量低得多,24 h的酯交换量分别为 26.8%和 31.5%.

2.4 无溶剂体系中 Span85修饰的猪胰脂酶催化茶油与亚油酸酯交换反应

Span85-PPL催化酯交换过程中酯交换量随时间的变化见图 4.由图 4可以看出,在无溶剂体系酶催化酯交换反应中,30℃下,相同时间内Span85-PPL催化酯交换的交换量与 PPL催化酯交换的交换量稍小 (差别较小),24 h的酯交换量分别为 7.2%和 5.1%;50℃下,Span85-PPL催化酯交换的交换量比 PPL催化酯交换的交换量高得多,随着反应时间的延长差别越来越明显,24 h的酯交换量分别为 21.2%和 15.6%;70℃下,Span85-PPL催化酯交换的交换量比 PPL催化酯交换的交换量低很多,24 h的酯交换量分别为22.3%和31.5%.

图4 Span85-PPL催化酯交换过程中酯交换量随时间的变化

3 结论

无溶剂体系中 Span修饰的猪胰脂酶在催化茶油与亚油酸酯交换反应的试验结果表明,30℃下,相同时间内 Span20-PPL、Span80-PPL和Span85-PPL催化酯交换的交换量与 PPL催化酯交换的交换量稍小(差别较小),24 h的酯交换量都在 4%～7.5%;50℃下,Span20-PPL、Span80-PPL和 Span85-PPL催化酯交换的交换量比 PPL催化酯交换的交换量高,24 h的酯交换量分别为19.9%、22.4%、21.2%和 15.6%;70℃下,Span20-PPL、Span80-PPL和 Span85-PPL催化酯交换的交换量比 PPL催化酯交换的交换量低,24 h的酯交换量分别为 23.7%、26.8%、22.3%和31.5%.

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TRANSESTER IFICATI ON OF CAMELL I A O IL AND L INOLEIC ACID CATALYZED BY SPAN-MOD IFIED PORCINE PANCREAS L IPASE IN SOLVENT-FREE SYSTEM

ZENG Jun,YANG Guo-long,B I Yan-lan,SUN Shang-de,ZHANG Jie
(School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou450052,China)

The paper studied the effects of catalysts,i.e.porcine pancreas lipase(PPL)modified by Span20,Span80 and Span85(Span20-PPL,Span 80-PPL and Span85-PPL),on the transesterification of camellia oil and linoleic acid in a solvent-free system.The results showed that the alyl incorporation of the reaction catalyzed by Span20-PPL,Span-80-PPL and Span85-PPL were slightly s maller than that of PPL at 30℃in the same ti me period,and the transeterification ratesof Span20-PPL,Span 80-PPL,Span85-PPL and PPL respectively reached 4% to 7.5%after 24-hour reaction;the transeterification rates of the reaction catalyzed by Span20-PPL,Span 80-PPL and Span85-PPL were higher than that of PPL at 50℃in the same time period,and the transeterification rates of Span20-PPL,Span 80-PPL,Span85-PPL and PPL respectively reached 19.9%,22.4%,21.2%and 15.6%after 24-hour reaction;and the transeterification rates of the reaction catalyzed by Span20-PPL,Span 80-PPL and Span85-PPL were s maller than that of PPL at 70℃in the same time period,and the transeterification rates of Span20-PPL,Span-80-PPL,Span85-PPL and PPL respectively reached 23.7%,26.8%,22.3% and 31.5% after 24-hour reaction.The effects of PPL modified by Span20,Span80 and Span85 on the acyl incorporation were related to the type of surfactant and the reaction temperature.

solvent-free system;Span-modified PPL;camellia oil;linoleic acid;transesterification;transesterification rate

TS201.2

B

1673-2383(2011)01-0010-04

2011-01-02

国家自然科学基金项目(31071558)

曾俊(1985-),男,河南信阳人,硕士研究生,研究方向为油脂化学.

＊通信作者