STP磷酸化处理对小麦面筋蛋白酶解特性的影响

朱永胜,王金水,渠琛玲,苏彩娟

(河南工业大学粮油食品学院,河南郑州 450052)

STP磷酸化处理对小麦面筋蛋白酶解特性的影响

朱永胜,王金水＊,渠琛玲,苏彩娟

(河南工业大学粮油食品学院,河南郑州 450052)

以复合蛋白酶为水解酶,研究了小麦面筋蛋白酶解前 STP磷酸化处理对其酶解特性的影响.通过单因素试验和正交试验确定磷酸化处理的最佳工艺条件为:STP添加量为小麦面筋蛋白的 9%,温度 25℃,pH8.5,处理时间 30 min.同时研究了 STP磷酸化处理后小麦面筋蛋白在酶解过程中的水解度和蛋白提取率的变化规律.

磷酸化处理;小麦面筋蛋白;酶解特性;水解度

0 引言

小麦面筋蛋白,又名活性面筋或谷朊粉,是小麦淀粉生产过程中的副产物,主要由醇溶蛋白和麦谷蛋白组成.由于小麦面筋蛋白中含有大量的疏水性氨基酸且分子内的疏水作用区域较大,导致其溶解性较低并限制了小麦面筋蛋白在食品工业中的应用[1].国内外学者通过对小麦面筋蛋白进行改性以拓宽其应用范围,其中酶法改性仅使肽键断裂而氨基酸的结构和构型保持不变,不会产生有毒、有害物质.因此随着人们对食品安全的日益关注,酶法改性将成为食品工业发展的必然趋势.但由于小麦面筋蛋白独特的结构和组成,酶解时蛋白酶不易靠近酶切位点,导致其酶解速度缓慢,水解不彻底,酶解产物复杂多变.因此,酶解前对小麦面筋蛋白做适当处理,使蛋白质变性或改变其组成及结构,有利于酶解的进行[2].

三聚磷酸钠 (STP)是我国 GB2760-1996和FDA允许使用的食品添加剂,STP对蛋白质进行磷酸化修饰可同时改善蛋白质的功能和营养性质[3].Ferrel等[4]认为在弱碱性 (pH7～9)环境中蛋白质分子中的自由氨基 (如赖氨酸ε-NH2)活性较大,因此可以接入一个磷酸根基团使其变成赖氨酸磷酸酯.磷酸根基团的引进增加了蛋白质的电负性,可提高蛋白质分子之间的静电斥力,改善蛋白质的溶解性.

因此,为了改善小麦面筋蛋白酶解特性,提高其蛋白质利用率,作者用 STP对小麦面筋蛋白酶解前进行磷酸化处理,研究了磷酸化处理对小麦面筋蛋白酶解特性的影响.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小麦面筋蛋白 (蛋白质含量 69.4%):市售;复合蛋白酶 (1.5×105U/g):丹麦诺维信;三聚磷酸钠 (STP):天津市瑞金特化学品有限公司.

1.2 仪器与设备

PHS—3C型 pH计:上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂;HJ—4型多头磁力搅拌器:江苏正基仪器有限公司;HH—2型数显恒温水浴锅:金坛市杰瑞尔电器有限公司;BS210S型电子天平:北京赛多利斯有限公司 ;LD5—2A型离心机:北京医用离心机厂;KDN—08C定氮仪:上海新嘉电子有限公司.

1.3 方法

1.3.1 磷酸化处理和酶水解方法

称取一定量的小麦面筋蛋白,加蒸馏水制成悬浮液后用磁力搅拌器搅拌,在搅拌过程中加入三聚磷酸钠 (STP),用 1 mol/L的NaOH调至最适pH,反应过程中维持温度和 pH恒定,反应完成后冷却,调 pH至 7.0.调节至酶的最适条件下进行酶解,测定水解度和蛋白提取率.

1.3.2 磷酸化程度测定方法[5]

磷酸化反应结束后取 5 mL反应溶液,加入过量的 10%三氯乙酸使蛋白质沉淀,4 000 r/min条件下离心 5 min,取上清液加入过量醋酸锌并调pH值在 3.8～3.9之间,使上清液中的焦磷酸以Zn2P2O2形式沉淀,然后用 pH10的氨缓冲液溶解Zn2P2O2,络黑 T作为指示剂,EDTA标准溶液滴定 Zn2+,用消耗的 EDTA体积表示磷酸化程度.

1.3.3 游离氨基氮的测定

甲醛滴定法[6].

1.3.4 水解度测定

1.3.5 蛋白提取率的测定

蛋白提取率是用来检测在酶解反应过程中,反应产物对原料蛋白的利用率.

将酶解液在 6 000 r/min条件下离心 20 min,取上清液,用凯氏定氮法测定其蛋白含量,即为水溶性蛋白质含量.

2 结果与分析

2.1 复合蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的最佳条件

根据厂家推荐参数和课题组前期试验成果,以水解度为指标,通过正交试验得到复合蛋白酶酶解小麦面筋蛋白的最优条件为:蛋白质浓度为5%,温度 50℃,pH值为 7.0,蛋白酶用量 [E/S]=3 500 U/g.

2.2 磷酸化处理时各因素对小麦面筋蛋白酶解特性的影响

考察了磷酸化处理过程中 STP添加量、反应时间、温度和 pH等因素对磷酸化程度的影响,以2.1中的最佳酶解条件对处理后的小麦面筋蛋白进行酶解,进而考察磷酸化处理时各因素对小麦面筋蛋白酶解特性的影响.

2.2.1 磷酸化处理 STP添加量对小麦面筋蛋白酶解特性的影响

在 STP添加量分别为 0、3%、6%、9%、12%的条件下,小麦面筋蛋白的磷酸化程度及其水解度的变化见图 1.

图1 磷酸化处理 STP添加量对小麦筋蛋白水解度的影响

由图 1可以看出,当 STP添加量为小麦面筋蛋白的 9%以下时,小麦面筋蛋白的水解度随着STP添加量的增加而逐渐升高;当添加 STP的量超过小麦面筋蛋白的 9%时,随着 STP添加量的增加虽然磷酸化程度继续增加,但小麦面筋蛋白的水解度呈下降趋势.其原因可能是蛋白质磷酸化改性的实质是其氨基酸残基磷酸酯化反应,随着磷酸化程度的增加,蛋白质的电负性也增加,从而提高了小麦面筋蛋白的溶解性,增加了有效水解位点,水解度增加.但如果 STP添加过多,过高的离子强度会增大蛋白质的疏水性,引起蛋白质及其亚基的变性凝聚,最终蛋白水解度呈下降趋势.因此,确定 STP添加量为 9%.

2.2.2 磷酸化处理时间对小麦面筋蛋白酶解特性的影响

在水解时间为 10、30、50、70、90 min的条件下,小麦面筋蛋白的磷酸化程度及其水解度的变化见图 2.

图2 磷酸化处理时间对小麦面筋蛋白水解度的影响

由图 2可知,在前 30 min内磷酸化反应迅速进行并基本完成,继续增加反应时间,磷酸化程度趋于平衡.磷酸化处理后的小麦面筋蛋白酶解时的水解度趋势也是如此,其水解度随着磷酸化程度的增加而提高,在处理 30 min时水解度达到最高值,此后增加处理时间水解度再无明显提高.因此,确定磷酸化处理时间为 30 min.

2.2.3 磷酸化处理 pH对小麦面筋蛋白酶解特性的影响

在处理 pH为 6、7、8、9、10的条件下 ,小麦面筋蛋白的磷酸化程度及其水解度的变化见图 3.由图3可知,由于蛋白质中的氨基酸残基在弱碱性环境中活性较大,反应比较容易进行,在 pH7～9之间时磷酸化程度最高,此时小麦面筋蛋白酶解时的水解度也最大.如果 pH过高,蛋白会被碱改性而变性,反而不利于磷酸化处理的进行,所以水解度也降低.因此,确定磷酸化处理时 pH值为 8.

图3 磷酸化处理 pH对小麦面筋蛋白水解度的影响

2.2.4 磷酸化处理温度对小麦面筋蛋白酶解特性的影响

图4 磷酸化处理温度对小麦面筋蛋白水解度的影响

在磷酸化处理温度为 20、25、30、35、40、45 ℃的条件下,小麦面筋蛋白的磷酸化程度及其水解度的变化见图 4.由图 4可知,磷酸化程度随温度的上升而快速增加,在 30℃时达到最大,此后随着温度的升高磷酸化程度反而下降.说明温度太高不利于磷酸化的进行,这与李瑜等[7]的研究结论一样.同时小麦面筋蛋白酶解时的水解度也是在磷酸化处理温度为 30℃时最大,故得出磷酸化处理的温度为 30℃.

2.3 正交试验

为了得到最佳的处理效果,根据单因素试验结果确定因素和水平,以水解度为指标,采用L9(34)正交表对磷酸化处理的条件进行正交优化试验,因素与水平见表1,试验结果见表2,方差分析见表3.

表1 正交试验因素与水平

表2 正交试验结果

由表2可知,影响因素的主次顺序为:C、D、A、B(主→次),即磷酸化处理温度对小麦面筋蛋白水解度影响最大,其次是 STP添加量和反应时间,磷酸化处理时 pH值对结果影响最小.最佳组合为 A2B2C1D2,即 STP添加量为小麦面筋蛋白的 9%,温度为 25℃,pH为 8.5,处理时间为30 min.

表3 正交试验方差分析

由表3可知,因素 C(磷酸化处理温度)和因素D(STP添加量)对试验结果影响显著 (P＜0.10),而因素 A(磷酸化处理时间)和 B(磷酸化处理 pH)对试验结果影响不显著.综合考虑极差分析和方差分析的结果,确定小麦面筋蛋白酶解前磷酸化处理的最佳条件为:A2B2C1D2,即 STP添加量为小麦面筋蛋白的 9%,温度为25℃,pH为 8.5,处理时间为 30 min.

由于正交表中不存在此种搭配方案,所以按照此搭配做试验验证,分别做 3组平行,并测定其蛋白提取率,结果如表4所示,平均水解度达9.9%.所以最终确定磷酸化处理最佳条件为A2B2C1D2.

表4 磷酸化处理的最佳条件验证试验结果

2.4 小麦面筋蛋白酶解过程中水解度和蛋白提取率的变化规律

在 2.3得出的最佳条件下对小麦面筋蛋白进行磷酸化处理,与未处理的小麦面筋蛋白作对比,其在酶解过程中水解度和蛋白提取率的变化规律见图 5和图 6.

图5 小麦面筋蛋白酶解过程中水解度的变化规律

图6 小麦面筋蛋白酶解过程中蛋白提取率的变化规律

从图 5和图 6可以看出,磷酸化处理和未处理的小麦面筋蛋白的水解度和蛋白提取率的变化规律都是随酶解时间的增加而升高.但在同一时刻,经 STP磷酸化处理的小麦面筋蛋白的水解度和蛋白提取率较未处理的均有明显提高.酶解开始后,由于处于酶的最适反应条件下,且酶的浓度和活性都比较高,酶解反应迅速进行,如图 5显示在前 9 h内小麦面筋蛋白的水解度增加较快.随着酶解反应的进行,由于反应体系中底物中用于被水解的肽键浓度的下降,酶解产物对酶解过程的抑制和整个反应环境 pH的下降,使得酶解反应速率下降,最终达到一个静态平衡阶段,如图 5所示,在反应 9 h后小麦面筋蛋白的水解度增加不明显,基本达到平衡.

蛋白提取率是酶解结束后上清液中总氮量占原料总氮量的百分比.由于酶解过程的实质是酶作为催化剂影响反应的速率,本身并不参加反应,小麦面筋蛋白酶解时仅仅是蛋白质分子中肽键的断裂,体现在蛋白分子质量的降低和离子性基团的增加,所以酶解过程中蛋白提取率的变化应该与其水解度的变化规律相同.如图 6所示,小麦面筋蛋白酶解过程中的蛋白提取率同样也是在 9 h内增加较快,此后逐渐趋于平衡.

由于 STP磷酸化处理的实质是蛋白质的氨基酸残基磷酸酯化,引入了大量的磷酸根基团,增加了蛋白质体系的电负性;另外由于磷酸根离子相互作用而促进了蛋白质 -水相互作用[8],提高了蛋白质的溶解度,增加了有效水解位点,提高了产物得率,所以在同一时刻,经 STP磷酸化处理后的小麦面筋蛋白的水解度和蛋白提取率较未处理的均有明显提高.

3 结论

(1)酶解前 STP磷酸化处理是提高小麦面筋蛋白酶解特性的有效方法.确定了小麦面筋蛋白酶解前 STP磷酸化处理的最佳条件:STP添加量为小麦面筋蛋白的 9%,温度为 25℃,pH为 8.5,处理时间为 30 min.

(2)小麦面筋蛋白热变性对磷酸化处理有阻碍作用.即当温度超过 30℃时,随着处理温度的升高,小麦面筋蛋白磷酸化程度逐渐下降.

(3)过高的离子强度不利于小麦面筋蛋白酶解的进行.当 STP添加量超过小麦面筋蛋白的9%时,过高的离子强度会增大蛋白质的疏水性,引起蛋白质及其亚基的变性凝聚,导致其水解度下降.

[1] 钮琰星,周瑞宝,黄凤洪.蛋白质酶水解物功能特性及其在食品工业应用[J].粮食与油脂,2003(5):16-18.

[2] 王金水,李露,韦志彦,等.挤压处理对小麦面筋蛋白酶解特性的影响[J].农产品加工,2009(2):16-18.

[3] Matheis G,John R W.Chemical phosphorylation of food protein:an overview and a prospectus[J]. Agriculture Food Chemistry,1984,32:699.

[4] Ferrel,Sung H Y.Chemical phosphorylation of food proteins by sodium trimetaphospbate[J].Food Science,1982,48:716.

[5] 田庆.SPI磷酸化改性程度与其酶解关系研究[J].粮食加工,2008,33(2):43-44.

[6] 大连轻工业学院,华南理工大学.食品分析[M].北京:中国轻工业出版社,1999.

[7] 李瑜,尹春明.化学磷酸化改性小麦面筋蛋白[J].食品工业科技,2002,23(5):19-21.

[8] 沈宁,杨光,孙亦鸣.花生蛋白磷酸化改性的研究[J].中国食品添加剂,2008(1):96-100.

INFLUENCE OF STP PHOSPHATE PROCESSING ON ENZY MATIC HYDROLYSIS CHARACTER ISTICS OFWHEAT GLUTEN

ZHU Yong-sheng,WANG Jin-shui,QU Chen-ling,SU Cai-juan
(School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou450052,China)

The paper studied the influence of the STP phosphate processing on the enzymatic hydrolysis characteristics of wheat gluten before enzymatic hydrolysis using a complex protease.Through singe factor experiments and orthogonal experiments,the paper deter mined the optimal conditions:the STP amount9%,temperature 25℃,pH 8.5,and reaction ti me 30 minutes.The paper also studied the change rule of the degree of hydrolysis and the protein extraction rate of the phosphate-processed wheat gluten during hydrolysis.

phosphate processing;wheat gluten;enzymatic hydrolysis characteristics;degree of hydrolysis

TS201.2

B

1673-2383(2011)01-0031-05

2010-10-15

国家自然科学基金项目 (31071496);河南省教育厅自然科学研究计划项目(2010A550001)

朱永胜 (1984-),男,山西寿阳人,硕士研究生,研究方向为食品生物技术.

＊通信作者