皱皮木瓜多糖的提取及其抗氧化活性研究

刘 捷,王 文,卢 奎,马 丽,张体祥

(河南工业大学化学化工学院,河南郑州 450001)

皱皮木瓜多糖的提取及其抗氧化活性研究

刘 捷,王 文,卢 奎,马 丽,张体祥

(河南工业大学化学化工学院,河南郑州 450001)

以皱皮木瓜为原料,采用水煮醇沉法研究了提取温度、提取时间、料液比、醇液比对水溶性木瓜多糖得率的影响,考察了木瓜多糖的抗氧化能力.通过正交试验确定了皱皮木瓜多糖的最佳提取工艺条件:温度 96℃、提取时间 3 h、醇液比 3︰1、料液比 1︰40,其中提取温度是影响提取工艺的显著因素,在最佳工艺条件下多糖得率达到 5.0%,多糖含量为 63.29%.皱皮木瓜多糖对具有显著的清除能力.

皱皮木瓜;多糖;提取工艺;正交试验;抗氧化活性

0 前言

皱皮木瓜 (Chaenom eles Speciosa(Sweet.)Nakai)为蔷薇科植物贴梗海棠,又称贴梗木瓜、贴梗海棠.木瓜的种类很多,皱皮木瓜为正品木瓜,主要分布于华中、华东和西南地区.木瓜味甜、肉滑、多汁,既可生吃,又可作佳肴,是一种药食同源的植物.作为一种常用中药,皱皮木瓜性温味酸,具有平肝舒筋、和胃化湿之功效[1],可用于预防和治疗风湿病、霍乱、肠炎、痢疾、脚气水肿等病症[2].木瓜含有多种对人体有益的营养成分和药用成分,如多种有机酸、糖类、黄酮、皂苷、氨基酸、蛋白酶类、维生素、矿物质等[3],具有很高的营养价值和药用价值.

木瓜集药用、食用、观赏价值于一身,资源丰富,应用前景非常广阔.国内对皱皮木瓜的开发正不断升温[4].多糖是皱皮木瓜果实中重要的生物活性物质,而目前对皱皮木瓜中多糖的研究还鲜有报道.作者研究了皱皮木瓜多糖的提取工艺及抗氧化活性,以期为皱皮木瓜多糖的开发提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

皱皮木瓜:采摘于郑州郊区,洗净、晒干、经粉碎后保存于冰箱中备用.

石油醚、95%乙醇、葡萄糖、硫酸、苯酚、磷酸二氢钾、氢氧化钾、邻苯三酚、磷酸氢二钠、0.1%茚三酮、碘 -碘化钾、10%α-萘酚等均为分析纯.

1.2 仪器与设备

RE—52型旋转蒸发器、SZ—93自动双重纯水蒸馏器:上海亚荣生化仪器厂;BL—3205电子天平 (精度 ≥0.01 g)、AY—120电子天平 (精度≥0.000 1 g):日本岛津公司;TU—1800PC紫外可见分光光度计:北京普析通用仪器有限责任公司;微型高速万能试样粉碎机:北京市永光明医疗仪器厂;HH—6数显恒温水浴锅:江苏常州国华电器有限公司.

1.3 方法

1.3.1 提取工艺

皱皮木瓜干品→粉碎→石油醚脱脂→热水浸提→减压抽滤→残渣重复浸提 1次→合并滤液→减压浓缩→乙醇沉淀→过滤→洗涤→真空干燥→皱皮木瓜粗多糖.

样品处理:将新鲜的皱皮木瓜去籽,烘干,在粉碎机中粉碎,过 40目筛,样品保存于干燥试剂瓶中.

脱脂:称取 30 g皱皮木瓜粉末,加入 100 mL乙醚回流 4 h.抽滤,风干.

热水浸提:称取 10 g脱脂后的皱皮木瓜粉末,加入一定量水,在一定温度、一定时间内浸提多次.

减压浓缩:过滤后的多糖溶液减压浓缩至100 mL.

醇沉:在浓缩后的多糖溶液中加入一定量95%乙醇,抽滤,分别用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤多次,真空干燥,得到皱皮木瓜粗多糖.

1.3.2 粗多糖的纯化——Sevag法[5-6]

在一定量粗多糖溶液中加入氯仿 -正丁醇(V/V=5︰1)混合溶剂 ,搅拌 20 min,在离心机中以 4 000 r/min的转速离心 20 min,去除多糖溶液层与有机溶液层交界处的变性蛋白质,重复数次直至中间无混浊沉淀为止.

1.3.3 多糖含量的测定

采用苯酚 -硫酸法[7].标准曲线的制作:精确称取 105℃干燥至恒重的无水葡萄糖 60 mg,置于 100 mL容量瓶中,加水溶解并稀释至刻度,摇匀,即得﹙每 1 mL中含无水葡萄糖 0.6 mg﹚对照品溶液.精确量取对照品溶液 0.0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL,分别置于 50 mL容量瓶中 ,加水至刻度,摇匀,精确量取上述各溶液 2 mL,置具塞试管中,分别加 4%苯酚溶液 1 mL,混匀,迅速加入浓硫酸 7.0 mL,摇匀,于 40℃水浴中保温 30 min,取出,置冰水浴中 5 min,取出,以第 1份为空白,在 490 nm的波长处测定吸光度,以吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线,如图 1所示.

图1 葡萄糖标准曲线

由图 1得到线性回归方程为:y=0.011 4x+0.002 2,R2=0.997 0.

样品多糖含量的测定:准确吸取样品溶液2.0 mL,置 10 mL具塞试管中,分别加入 4%苯酚溶液 1.0 mL,摇匀,迅速加入浓硫酸 7.0 mL,摇匀,于 40℃水浴中保温 30 min,取出,置冰水浴中 5 min,取出,以第 1份为空白对照液,在 490 nm波长处测定各样品吸光度,由标准曲线计算样品溶液中的多糖含量.

1.3.4 粗多糖得率的计算

1.3.5 理化性质

1.3.5.1 碘 -碘化钾反应

将精制木瓜多糖样品制成 1 mg/mL溶液,取1 mL多糖溶液加入碘 -碘化钾溶液,观察颜色变化.

1.3.5.2 茚三酮反应

取 1 mL 1 mg/mL的精制木瓜多糖溶液,加入0.5 mL 0.1%茚三酮乙醇溶液,混匀,煮沸 1～2 min,冷却,观察颜色变化.

1.3.5.3 Molish反应

取 1 mL浓度为 1 mg/mL的精制木瓜多糖溶液,加入 2滴Molish试剂即 10%α-萘酚的乙醇溶液,混合均匀后将试管倾斜 45°,沿试管壁慢慢加入 1 mL浓硫酸 (勿摇动),竖立试管,观察浓硫酸和糖交界面颜色的变化.

1.3.6 抗氧化活性的测定

超氧自由基清除能力测定[8]:于比色管中加入 2.25 mL pH 8.34磷酸盐缓冲液 (PBS)、2 mL水和 0.25 mL 10 mmol/L邻苯三酚,稀释至 4.5 mL.混匀后 25℃保温,在第 4分钟时加入 1滴 10 mol/L HCl中止反应.以 PBS作为参比溶液,在325 nm处测定反应后溶液的吸光度值 (A空).

测定样品的清除能力时,方法如上,只是将样品溶液代替蒸馏水.终止反应后,以相同浓度的样品溶液作为参比溶液,在 325 nm处测定反应后溶液的吸光度值 (A样).

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 提取温度对多糖得率的影响

在料液比 1︰10、时间 1 h、提取次数 2次、醇液比 2︰1的条件下,不同提取温度对多糖得率的影响如图 2所示.

由图 2可以看出,随着提取温度的升高,多糖得率逐渐增加,而且变化幅度比较大,说明温度对多糖得率影响较大.因为温度升高,溶剂的渗透能力和溶解能力增强,有利于多糖的渗出.但是温度过高会破坏多糖的生物活性,改变其高级结构,颜色加深,黏度增大,不利于多糖的纯化分离.温度过高也不利于节省能源.从图 2可以看到,当温度达到 90℃以上时,多糖的得率变化不大,因此,温度选择 90℃较好.

图2 提取温度对多糖得率的影响

2.1.2 料液比对多糖得率的影响

在提取温度 96℃(100℃时溶液剧烈沸腾,溶剂蒸发很快,96℃时多糖的得率也比较高,因此选择这个温度)、时间 1 h、提取次数 2次、醇液比 2︰1的条件下 ,不同料液比 1︰10、1︰20、1︰30、1︰40、1︰50对多糖得率的影响如图 3所示.

图3 料液比对多糖得率的影响

由图 3可以看出,随着料液比的增加,多糖得率逐渐上升,但是变化的幅度比较小,说明料液比对多糖得率影响较小.浸提用蒸馏水增加,消耗能量增加,后续浓缩工作量加大,浸提用蒸馏水越多,多糖损失的可能也越大,消耗的能量也越多.因此,料液比以 1︰30为宜.

2.1.3 提取时间对皱皮木瓜多糖得率的影响

在 96 ℃、料液比 1︰10、醇液比 2︰1的条件下 ,不同提取时间 (2、3、4、5、6 h)对多糖得率的影响如图 4所示.

从图 4可看出,随着提取时间的延长,多糖得率先增加,随后又下降.当提取时间为 3 h时,多糖得率达到最大.但是提取时间延长,多糖得率变化不大,在提取过程中多糖的损失也大.因此,提取时间 3 h较好.

图4 提取时间对多糖得率的影响

2.1.4 醇液比对多糖得率的影响

在 96℃、料液比 1︰10、提取时间为 1 h条件下 ,不同醇液比 (2︰1、3︰1、4︰1、5︰1、6︰1)对多糖得率的影响见图 5.

图5 醇液比对多糖得率的影响

从图 5可以看出,随着醇液比的增加,多糖得率随之增大,当醇液比为 3︰1时,多糖得率最大,再增加乙醇量,多糖得率反而开始下降.这可能是因为乙醇浓度变大时多糖醇溶量增大.因此,选择醇液比 3︰1.

2.2 正交试验

由单因素试验得出的条件,综合各方面因素考虑,以提取温度、提取时间、料液比和醇液比 4个因素进行正交试验,结果见表1～表3.

表_1正交试验水平因素

从表2可以看出,极差顺序:A＞C＞B＞D,即试验因素中对多糖得率影响的顺序为:温度 ＞料液比 ＞提取时间 ＞醇液比.温度对多糖得率影响显著,料液比的影响次之,提取时间和醇液比对多糖得率的影响较小.优化后的提取工艺为A3B2C3D2,即温度 96℃,提取时间 3 h,醇液比3︰1,料液比 1︰40.

2.3 验证试验

称取 3 g皱皮木瓜粉,脱脂,在温度 96℃、提取时间 3 h、醇液比 3︰1、料液比 1︰40的最佳工艺条件下提取多糖,试验结果得到多糖得率为5.0%,此时的多糖含量为 63.29%.与正交试验结果一致.

表2 正交试验结果

表3 方差分析表

2.4 粗多糖的纯化——去蛋白

木瓜粗多糖经 Sevag法脱蛋白后,颜色由棕色变为灰白色粉末,多糖含量达到 80%.

2.5 多糖的理化性质与光谱分析

2.5.1 多糖的理化性质

纯化后的木瓜多糖难溶于冷水,能溶于热水,不溶于乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等有机溶剂.

木瓜多糖溶液遇碘变蓝色.木瓜多糖溶液与茚三酮混合加热,未出现蓝色,说明木瓜多糖不含蛋白质.木瓜多糖与 Molish试剂反应显紫色.糖类物质与 Molish试剂即α-萘酚试剂反应都能显色.

2.5.2 紫外 -可见光谱分析

皱皮木瓜多糖在 260 nm和 280 nm处无吸收,说明它不含蛋白质、多肽和核酸.

2.5.3 红外光谱分析

纯化后的皱皮木瓜多糖的红外光谱见图 6.

木瓜多糖的红外光谱的特征吸收峰及归属如下:在 3 401 cm-1附近的强吸收峰为 O—H的伸缩振动峰;2 928 cm-1处的峰是 C—H的伸缩振动;1 100～1 010 cm-1范围内出现的强吸收峰,为葡萄糖的特征吸收[9],1 639 cm-1处的峰为的非对称伸缩振动.840 cm-1是α-多糖的特征吸收,890 cm-1处无吸收峰,可以确定不含有β-多糖.770 cm-1附近的吸收峰为 D-吡喃葡萄糖的吸收[10].可见木瓜多糖结构中存在α-吡喃糖苷键.

图6 木瓜多糖的红外光谱

2.6 超氧自由基清除能力的分析

木瓜多糖对超氧自由基的清除结果如图 7所示.

图7 木瓜多糖对超氧自由基的清除能力

从图 7可看出,木瓜多糖对超氧自由基清除能力显著,且随着多糖浓度的增大,清除能力逐渐增大.表明木瓜多糖对超氧自由基的清除率与多糖用量存在量效关系.当木瓜多糖浓度达到 3 mg/mL时,清除率达到 81%.

3 结论

采用水提醇沉法从皱皮木瓜中提取水溶性多糖,考察了提取温度、提取时间、料液比和醇液比对木瓜多糖得率的影响,根据正交试验确定了提取温度是显著影响因素,优化后的提取工艺条件为:温度 96℃,提取时间 3 h,醇液比 3︰1,料液比1︰40.在该工艺条件下,木瓜多糖得率达到5.0%,多糖含量为 63.29%.经 Sevag法纯化,木瓜多糖含量达到 80%.

红外光谱表明皱皮木瓜多糖是含α-吡喃糖苷键的化合物.

木瓜多糖对超氧自由基具有明显的清除能力.当多糖浓度达到 3 mg/mL时,清除率达到80%以上.

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EXTRACTI ON AND ANTI OXIDATI ON ACTI V ITY OF POLYSACCHAR IDES FROMCHAENOM ELES SPECIOSA(S WEET.)NAKA I

L IU Jie,WANGWen,LU Kui,MA Li,ZHANG Ti-xiang
(School of Chem istry and Chem ical Engineering,Henan University of Technology,Zhengzhou450001,China)

The paper studied the influences of extraction temperature,extraction time,material-to-liquid ratio and ethanol-to-liquid rate on the yield of water soluble polysaccharides extracted fromChaenom eles Speciosa(Sweet.)Nakai by hotwater extraction and precipitation with ethanol,and investigated the antioxidation activity of the polysaccharides.Through the orthogonal experiments,the paper determined the optimal extraction conditions of the polysaccharides fromChaenom eles Speciosa(Sweet.)Nakai:extraction temperature 96℃,extraction time 3 hours,material-to-liquid ratio 1︰40 and ethanol-to-liquid ratio 3︰1.The extraction temperature was the notable factor influencing the extraction technology.Under the optimal conditions,the yield of polysaccharides reached 5.0%,and the contentofpolysaccharides reached 63.29%.The test showed that the polysaccharides extracted fromChaenom eles Speciosa(Sweet.)Nakai had remarkable ability in scavenging·

Chaenom eles Speciosa(Sweet.)Nakai;polysaccharides;extraction technology;orthogonal experiment;antioxidation activity

TS201.2

B

1673-2383(2011)01-0048-05

2010-09-03

河南工业大学博士科研基金项目(150049)

刘捷 (1970-),女,河南郑州人,博士,副教授,研究方向为天然产物化学.