马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶新基因(Dd-cpl-1) 的克隆与序列分析

王高峰，彭德良，孙建华，黄文坤，彭焕，龙海波

1 天津师范大学生命科学学院，天津 300387

2 中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193

马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶新基因(Dd-cpl-1) 的克隆与序列分析

王高峰1,2，彭德良2，孙建华1，黄文坤2，彭焕2，龙海波2

1 天津师范大学生命科学学院，天津 300387

2 中国农业科学院植物保护研究所 植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193

L型半胱氨酸蛋白酶基因 (Cathepsin L-like cysteine proteinase gene) 为与植物寄生线虫寄生能力相关的多功能基因。运用RT-PCR和RACE的方法从马铃薯腐烂茎线虫Ditylenchus destructor中克隆出1个L型半胱氨酸蛋白酶新基因 Dd-cpl-1 (GenBank登录号为 GQ180107)。该基因 Dd-cpl-1 cDNA全长序列含有 1个 1 131 bp的开放性阅读框(ORF)，编码376个氨基酸残基，其5′末端及3′末端分别含有29 bp和159 bp的非编码区 (UTR)。Dd-cpl-1内含子外显子结构分析结果表明，其基因组序列包含7个内含子，且各内含子两端剪接位点序列遵守GT/AG规则。Dd-cpl-1基因推定的蛋白Dd-CPL-1与松材线虫L型半胱氨酸蛋白酶高度同源，一致性达到77%。以不同物种中L 型半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列进行比对分析，推测推定的蛋白 Dd-CPL-1含有 L型半胱氨酸蛋白酶基因家族高度保守的催化三联体(Cys183，His322和Asn343) 以及ERFNIN基系和 GNFD基系。半胱氨酸蛋白酶系统发育分析表明，Dd-cpl-1 属于由 L型半胱氨酸蛋白酶组成的进化分支。Dd-cpl-1的这些序列特征进一步表明其为L型半胱氨酸蛋白酶基因。这是首次在马铃薯腐烂茎线虫中克隆到的L型半胱氨酸蛋白酶，为今后在蛋白水平对其进行进一步的功能分析提供基础。

马铃薯腐烂茎线虫，L型半胱氨酸蛋白酶，Dd-cpl-1

Abstract:The Cathepsin L-like cysteine proteinase genes (cpls) are multifunction genes related to the parasitic abilities of plant parasitic nematodes. A new cathepsin L-like cysteine proteinase gene (Dd-cpl-1) (GenBank Accession GQ 180107) was cloned fromDitylenchus destructor by RT-PCR and RACE. The cDNA sequence consisted of a 1 131 bp open reading frame (ORF) encoding 376 amino acid residues that were franked by a 29 bp 5′-untranslated region (UTR) and a 159 bp 3′-UTR. Genomic sequence analysis showed that Dd-cpl-1 contained 7 introns, obeyed the GT/AG rule in the splice-site junctions. Homology analysis showed that the identity was 77% between Dd-cpl-1 deduced protein Dd-CPL-1 and cathepsin L-like cysteine proteinase of Bursaphelenchus xylophilus. Multi-sequence alignment indicated that there were the catalytic triad (Cys183, His322and Asn343) and two motifs ERFNIN motif and GNFD motif in deduced protein Dd-CPL-1. Cysteine proteinases phylogenetic analysis showed that Dd-cpl-1 belonged to the sub-clade of cathepsin L-like cysteine proteinases.

Keywords:Ditylenchus destructor, cathepsin L-like cysteine proteinase, Dd-cpl-1

由马铃薯腐烂茎线虫Ditylenchus destructor 引起的甘薯茎线虫病是制约我国甘薯生产的三大病害之一，近年来已成为北方薯区最严重的病害。马铃薯腐烂茎线虫Ditylenchus destructor Thorne，又称马铃薯茎线虫，是1945年作为一个单独的种从鳞球茎茎线虫 Ditylenchus dipsaci 中分离出来的，许多国家和地区都将其列为检疫性有害生物[1-3]。2006年葛建军等在国内首次报道从马铃薯上分离到马铃薯腐烂茎线虫[4]。宛菲等对来自国内的21个马铃薯腐烂茎线虫种群及1个韩国马铃薯腐烂茎线虫种群的rDNA-ITS进行测序研究，根据ITS扩增片段大小将其分为A型和B型2类群体[3]。依据D2/D3序列对上述 22个马铃薯腐烂茎线虫不同种群进行系统进化分析，结果表明 A型和 B型种群形成 2个亚进化分支，这说明了马铃薯腐烂茎线虫A型和B型群体在ITS区差异的实质[5]。对马铃薯腐烂茎线虫的分子生物学研究相对于其他植物寄生线虫而言比较滞后，目前只从马铃薯腐烂茎线虫中克隆出 3个乙酰胆碱酯酶基因 (Acetylcholinesterase gene)[6-8]和 2个 β-1,4-内切葡聚糖酶基因 (β-1,4-endoglucanase gene)[9]。

L型半胱氨酸蛋白酶 (Cathepsin L-like cysteine proteinase) 亚基因家族为半胱氨酸蛋白酶(Cysteine proteinase) 基因家族成员之一[10]。半胱氨酸蛋白酶为多种内寄生生物的许多重要生理过程所必需，如蜕皮、角质层重塑、胚胎发生、取食及免疫逃避[11]。Urwin等首次从植物寄生线虫大豆孢囊线虫Heterodera glycines中克隆出1个L型半胱氨酸蛋白酶基因[12]。现已从植物寄生线虫中克隆到多个 L型半胱氨酸蛋白酶基因，如大豆孢囊线虫(GenBank Accession No. CAA70693)、南方根结线虫Meloidogyne incognita (GenBank Accession No.CAD89795)、马铃薯白线虫 Globodera pallida(GenBank Accession No. AAY45896)、肾状肾形线虫Rotylenchulus reniformis (GenBank Accession No.AAY45870) 和松材线虫Bursaphelenchus xylophilus(GenBank Accession No. ACH56225)。在秀丽小杆线虫Caenorhabditis elegans中发现，Ce-cpl-1为其早期胚胎发生所需[13-14]，参与秀丽小杆线虫卵黄蛋白修饰的调节过程[15]。人体寄生线虫马来丝虫 Brugia malayi成年雌虫中的Bm-cpl-1和Bm-cpl-5与秀丽小杆线虫中的L型半胱氨酸蛋白酶基因为不同种系但功能相同的基因 (Functional orthologs)[11]。在南方根结线虫中，对Mi-cpl-1进行原位杂交实验，结果表明其表达部位为南方根结线虫肠道细胞，推测Mi-cpl-1可能主要在南方根结线虫肠道中起消化作用[10]。Shingles等对 Mi-cpl-1的实时表达情况进行分析，结果发现Mi-cpl-1在南方根结线虫整个生长发育阶段的表达水平较高，且 RNAi实验结果表明Mi-cpl-1与南方根结线虫的寄生能力相关[16]。因此，植物寄生线虫L型半胱氨酸蛋白酶参与植物寄生线虫侵染寄主植株的过程，但其具体生物学功能仍不确定。在本研究中，用简并引物FP和RP[17]从马铃薯腐烂茎线虫中首次克隆出1个L型半胱氨酸蛋白酶基因，为今后在蛋白水平对其进行进一步的功能分析提供了基础。

1 材料与方法

1.1 线虫材料

马铃薯腐烂茎线虫为本实验室收集、培养和保存的实验种群。马铃薯腐烂茎线虫培养方法为：在PDA培养基上接种半裸镰刀菌 Fusarium semitectum，25 ℃培养4 d后，将马铃薯腐烂茎线虫接种在半裸镰刀菌上，马铃薯腐烂茎线虫以半裸镰刀菌为食，25 ℃条件下进行生长繁殖[8,18-19]。培养40~50 d后收集培养皿盖上的线虫，用DEPC处理水多次洗涤后，将约100 µL的线虫加入到1.5 mL的DNase/RNase-free离心管中，并加入1 mL TRIzol，液氮速冻，–80 ℃保存备用。

大肠杆菌感受态TOP010；普通DNA纯化试剂盒 (天根生化科技有限公司)；EX Taq 酶 (TaKaRa公司)；TRIzol 试剂、Gene Race®Core Kit 及SuperScripeTMIII First-Strand Synthesis System for RT-PCR 试剂盒 (Invitrogen 公司)，pGEM-T easy系统试剂盒 (Promega公司)。

1.2 马铃薯腐烂茎线虫总RNA提取及cDNA第一链合成

采取冻融法用 TRIzol试剂提取马铃薯腐烂茎线虫的总 RNA。按照 Gene Race®Core Kit及SuperScripeTMIII First-Strand Synthesis System for RT-PCR 试剂盒说明书步骤合成 5′端及 3′端完整的cDNA第一链。

1.3 马铃薯腐烂茎线虫的基因组DNA的提取

线虫 DNA的提取参照彭德良的方法[20]，略有改动。挑取 10头马铃薯腐烂茎线虫于含有 10 µL ddH2O 的0.2 mL Eppendorf管中，在液氮中速冻，用75%酒精消毒并用酒精灯烤干后自然冷却的玻璃棒研磨至冰融化，反复3次，加入7 µL的WLB (Worm lysis buffer)，3 µL 蛋白酶 K 溶液 (600 µg/mL)，混匀，4 000 r/min离心5~10 s收集虫液于管底，–20 ℃冷冻30 min以上，然后转入PCR仪，在65 ℃下温育1.5 h，95 ℃反应10 min，取出后12 000 r/min离心1 min，取上清，于–20 ℃保存备用。

1.4 马铃薯腐烂茎线虫cDNA片段的同源克隆

以简并引物FP和RP为引物 (表1)，以cDNA第一链为模板进行 PCR扩增，反应条件为：94 ℃预变性 3 min；94 ℃变性 30 s，48 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。扩增的PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测和分离，用普通DNA纯化试剂盒纯化后连接到pGEM-T载体中，转化 TOP010感受态细胞，挑取阳性单克隆摇菌，以FP、RP为PCR引物，用上述同样的反应条件进行菌液检测，送上海生工生物工程有限公司测序。

表1 本研究所用的PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

1.5 3′ RACE

根据测序获得的EST片段，用软件Primer 5.0及DNAMAN设计基因特异引物CPF1、CPF2 (表1)，以cDNA第一链为模板，以3′ GeneRace Primer及CPF1为引物，PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，72 ℃延伸1 min，5个循环；94 ℃变性30 s，70 ℃延伸 1 min，5个循环；94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，25个循环；72 ℃延伸10 min。再以该PCR产物为模板，以3′ GeneRace Nested Primer和 CPF2为 PCR引物，进行 Nested PCR，PCR反应条件与上述PCR反应条件相同。PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，纯化目的片段，再进行连接、转化、克隆、PCR菌液检测后测序。

1.6 5′ RACE

根据测序获得的EST片段，用软件Primer 5.0及 DNAMAN设计基因特异引物 CPR1、CPR2(表 1)。以 cDNA 第一链为模板，以 CPR1和 5′GeneRace Primer为引物，进行PCR扩增；再以PCR产物为模板，以CPR2和5′ GeneRace Nested Primer为引物，进行 Nested PCR；PCR反应条件与 3′RACE相同。PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，纯化目的片段，再进行连接、转化、克隆、PCR菌液检测后测序。

1.7 cDNA全长扩增

依据 cDNA拼接序列，用软件 Primer 5.0及DNAMAN设计基因特异引物CPF3、CPR3 (表1)，对cDNA序列进行全长扩增。以cDNA第1链为模板，以CPF3、CPR3为引物进行PCR扩增，PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，65 ℃延伸2 min，5个循环；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸2.5 min，25个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，纯化目的片段，再进行连接、转化、克隆、PCR菌液检测后测序。

1.8 基因组序列克隆

依据已获得的目的基因cDNA序列，用Primer 5.0及 DNAMAN在两端非编码区及其附近设计基因特异引物CPF4、CPR4 (表1)。以马铃薯腐烂茎线虫DNA为模板，以CPF4与CPR4为引物进行PCR反应，扩增目的基因基因组序列。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，37个循环；72 ℃延伸 10 min。PCR产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳分离，纯化目的片段，再进行连接、转化、克隆、PCR菌液检测后测序。

1.9 L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA序列及其编码蛋白氨基酸序列分析

在 NCBI网站 (www.ncbi.nlm.nih.gov/) 进行基因Blastx同源比对分析，用软件DNAMAN对基因cDNA序列进行开放性阅读框预测及其核苷酸序列翻译，以软件MEGA 4.0 UPGMA算法构建系统树。以Compute pI/Mw (http://www.expasy.org/tools/pi_tool.html) 进行蛋白分子量 (Mw) 预测。以 GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/) 进行基因内含子外显子结构分析。以 SingalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 进行蛋白质信号肽预测。

2 结果与分析

2.1 马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA全长克隆与序列分析

用简并引物进行PCR扩增，纯化此扩增产物并进行测序，结果获得1个498 bp的cDNA片段 (图1)。经Blastx分析发现该片段与松材线虫L型半胱氨酸蛋白酶 (GenBank登录号：ACH56255) 高度同源，一致性 (Identities) 达到83%，表明实验获得的cDNA片段为目的基因L型半胱氨酸蛋白酶基因片段。依据马铃薯腐烂茎线虫中该目的基因cDNA片段核苷酸序列设计基因特异引物，用RACE技术对目的基因3′和5′ cDNA末端序列进行克隆，测序结果表明，其大小分别为383 bp和606 bp (图2，图3)。对已获得的3个cDNA片段进行序列拼接，结果获得了1个全长为1 319 bp的cDNA序列。在该cDNA序列两端设计基因特异引物，进行PCR扩增、测序，结果得到了1个大小为966 bp的cDNA片段(图4)。将此966 bp的cDNA片段和目的基因cDNA拼接序列进行比对分析，分析结果显示两序列一致，这表明马铃薯腐烂茎线虫中所获得的L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA拼接序列正确。马铃薯腐烂茎线虫中该L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA全长含有1个 1 131 bp的开放性阅读框，其 5′端起始密码子ATG前有1个大小为 29 bp的非编码区，3′端有 1个159 bp的非编码区，且3′端有多聚腺苷酸尾及加尾信号 (AATAAA)。这表明马铃薯腐烂茎线虫中该L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA序列为完整序列，并命名为Dd-cpl-1，其GenBank登录号为GQ 180107。

图1 CP简并引物PCR扩增Fig. 1 Agarose gel (1.0%) showing the PCR product of degenerate primers FP & RP. M: DL2000 marker; 1: PCR product of degenerate primers FP & RP.

图2 Dd-cpl-1基因3′ RACE扩增Fig. 2 Agarose gel (1.0%) showing the PCR product of Dd-cpl-1 3′ RACE. M: DL2000 plus marker; 2: PCR product of Dd-cpl-1 3′ RACE.

图3 Dd-cpl-1基因5′ RACE扩增Fig. 3 Agarose gel (1.0%) showing the PCR product of Dd-cpl-1 5′ RACE. M: DL2000 marker; 3: PCR product of Dd-cpl-1 5′ RACE.

2.2 马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶基因基因组序列克隆及序列分析

根据已获得的马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶基因 cDNA全长序列，设计基因特异引物CPF4和 CPR4，以马铃薯腐烂茎线虫 DNA为模板扩增目的基因的基因组序列并测序，结果获得了 1个2 242 bp大小的DNA片段 (图5)。依据马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA全长序列及其基因组序列进行内含子外显子结构分析发现，马铃薯腐烂茎线虫 L型半胱氨酸蛋白酶基因含有 7个内含子，且内含子两端拼接位点序列遵守GT/AG规则 (图 6)。

2.3 马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列分析

图4 Dd-cpl-1基因cDNA全长PCR扩增Fig. 4 Agarose gel (1.0%) showing the PCR product of CPF3& CPR3. M: DL2000 plus marker; 4: PCR product of CPF3 &CPR3.

图5 马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶基因基因组序列PCR扩增Fig. 5 Agarose gel (1.0%) showing the PCR product of CPF4& CPR4. M: DL2000 plus marker; 5: PCR product of CPF4 &CPR4.

根据马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA全长序列推测其编码蛋白含有376个氨基酸残基，分子质量约为42.4 kDa。以SingalP 3.0对马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶进行信号肽预测，结果显示在其氨基端含有1个由20个氨基酸残基组成的信号肽。以来自不同物种的4种L型半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列进行序列比对分析，推测马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶含有保守的催化三联体，分别为Cys183、His322和Asn343，且含有ERFNIN基系和GNFD基系 (图7)。这表明，从马铃薯腐烂茎线虫中所克隆到的基因Dd-cpl-1具有L型半胱氨酸蛋白酶基因家族所具有的序列特征[21-24]，进一步证明其为L型半胱氨酸蛋白酶基因。

图6 马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶基因内含子外显子结构分析结果Fig. 6 Intron-exon structure analysis result of cathepsin L-like cysteine proteinase from D. destructor.

图7 马铃薯腐烂茎线虫与其他物种中L型半胱氨酸蛋白酶氨基酸序列比对分析Fig. 7 Multi-sequence alignment of cathepsin L-like cysteine proteinases from D. destructor and other organisms. AAL16954,AAY45870, XP_002638172, Dd-CPL-1 is the CPL of Delia radicum, Rotylenchulus reniformis, Caenorhabditis briggsae and Ditylenchus destructor, respectively; Catalytic triad of Cys, His and Asn (*); Two conserved motifs of ERFNIN and GNFD (--).

2.4 不同类型半胱氨酸蛋白酶系统进化分析

马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶与不同物种中不同类型的半胱氨酸蛋白酶系统进化分析表明，其系统进化树包含 4个进化分支 (Subclade)，分别由B型、L型、S型及Z型半胱氨酸蛋白酶组成；其中，L型半胱氨酸蛋白酶进化分支包含 2个支系，第 1个支系由植物寄生线虫、人寄生线虫捻转血矛线虫 Haemonchus contortus和自由生线虫秀丽小杆线虫L型半胱氨酸蛋白酶组成，另1个支系由非线虫动物蓖子硬蜱 Ixodes ricinus、甜菜夜蛾Spodoptera exigua、菜蛆Delia radicum与黄粉甲虫Tenebrio molitor L型半胱氨酸蛋白酶组成 (图8)。这表明，马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶同松材线虫、秀丽小杆线虫、大豆孢囊线虫、捻转血矛线虫、马铃薯白线虫、肾状肾形线虫和南方根结线虫L型半胱氨酸蛋白酶亲缘关系较近。同源比对分析结果显示，马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶与上述 7种线虫 L型半胱氨酸蛋白酶一致性(Identities) 分别为77%、67%、66%、65%、64%、64%和 60%，这再一次表明马铃薯腐烂茎线虫的Dd-cpl-1为L型半胱氨酸蛋白酶基因。

3 讨论

研究发现，南方根结线虫Mi-cpl-1在南方根结线虫肠道细胞中表达[10]，并且在其整个发育过程中的表达量很高，同时还与南方根结线虫的寄生能力表现出相关性[16]。但至今仍未见关于植物寄生线虫L型半胱氨酸蛋白酶组织免疫定位分析的报道。马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶信号肽预测结果表明，其氨基端有1个由20个氨基酸残基组成的信号肽，这表明马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶为分泌型蛋白。马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶的组织免疫定位分析，将为阐明该酶在马铃薯腐烂茎线虫侵染寄主过程中的具体生物学功能提供新的线索。

图8 不同物种间半胱氨酸蛋白酶系统进化树Fig. 8 Phylogenetic trees of cysteine proteinases from different species.: Cathepsin L-like cysteine proteinase (Ce-CPL-1) from free-living nematode C. elegans; : Cathepsin L-like cysteine proteinase (Hc-CPL-1) from human parasitic nematode Haemonchus contortus; : Cathepsin L-like cysteine proteinase cloned from D. destructor. The GenBank Accession No. and the species’ names of different cysteine proteinases are indicated in the ends of every branch.

人寄生线虫捻转血矛线虫L型半胱氨酸蛋白酶基因Hc-cpl-1能够对秀丽小杆线虫L型半胱氨酸蛋白酶基因Ce-cpl-1缺失突变体进行功能补偿。因此推测动物寄生线虫中的L型半胱氨酸蛋白酶基因与秀丽小杆线虫L型半胱氨酸蛋白酶基因功能同源[25]，Ford等的实验结果进一步支持了这一观点[11]。但目前仍未有证据表明植物寄生线虫L型半胱氨酸蛋白酶基因同动物寄生线虫L型半胱氨酸蛋白酶基因一样，与秀丽小杆线虫L型半胱氨酸蛋白酶基因功能同源。本研究中，以来自不同物种的B型、L型、S型和Z型半胱氨酸蛋白酶进行系统进化分析，结果表明，秀丽小杆线虫、捻转血矛线虫与包括马铃薯腐烂茎线虫在内的5种植物寄生线虫L型半胱氨酸蛋白酶形成一个支系，独立于由非线虫动物中的 L型半胱氨酸蛋白酶所形成的另一个支系 (图 8)。这表明，植物寄生线虫中的L型半胱氨酸蛋白酶基因与秀丽小杆线虫及捻转血矛线虫L型半胱氨酸蛋白酶基因Ce-cpl-1和Hc-cpl-1亲缘关系较近。由此推测，植物寄生线虫L型半胱氨酸蛋白酶基因可能与动物寄生线虫和秀丽小杆线虫L型半胱氨酸蛋白酶基因为不同种系但功能相同的基因，其参与植物寄生线虫的早期胚胎发育等过程。马铃薯腐烂茎线虫L型半胱氨酸蛋白酶基因cDNA全长与基因组序列的克隆及其相关序列特征分析为今后在蛋白水平阐明该基因的生物学功能提供了基础。

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Cloning and sequence analysis of a new cathepsin L-like cysteine proteinase gene from Ditylenchus destructor

Gaofeng Wang1,2, Deliang Peng2, Jianhua Sun1, Wenkun Huang2, Huan Peng2, and Haibo Long2
1 College of Life Sciences, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China
2 The State Key Laboratory for Biology of Plant Disease and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China

Received: April 23, 2010; Accepted: June 12, 2010

Supported by: National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2010CB833603), National Natural Science Foundation of China (No.30872404).

Corresponding author: Jiye Cai. Tel/Fax: +86-20-85223569; E-mail: tjycai@jnu.edu.cn

国家重点基础研究发展计划 (973计划) (No. 2010CB833603)，国家自然科学基金 (No. 30872404) 资助。