Ad-ING4-IL-24双基因共表达对人肺腺癌化疗的增敏效应

朱晔涵，杜贤荣，陈华昕，谢宇锋，盛伟华，杨吉成

1 苏州大学附属第一医院呼吸内科，苏州 215006

2 苏州大学医学部 细胞与分子生物学教研室，苏州 215123

Ad-ING4-IL-24双基因共表达对人肺腺癌化疗的增敏效应

朱晔涵1，杜贤荣1，陈华昕1，谢宇锋2，盛伟华2，杨吉成2

1 苏州大学附属第一医院呼吸内科，苏州 215006

2 苏州大学医学部 细胞与分子生物学教研室，苏州 215123

研究ING4 (肿瘤生长抑制因子4) 和IL-24 (人白细胞介素24) 双基因共表达腺病毒载体 (Ad-ING4-IL-24) 对肺腺癌的化疗增敏效应及分子机制。将Ad-ING4-IL-24感染A549肺癌细胞及联合顺铂 (DDP) 化疗药物作用，RT-PCR和Western blotting检测ING4和IL-24基因在A549肺癌细胞中的转录和表达，MTT法、流式细胞仪 (FCM) 和 Hoechst染色法检测Ad-ING4-IL-24联合DDP (联合组) 对A549肺癌细胞的生长抑制和凋亡效应。采用A549细胞株建立人肺腺癌裸鼠模型，然后瘤体局部注射干预用药，动态测量肿瘤体积，并计算瘤重抑瘤率，免疫组化检测ING4、IL-24、bax、bcl-2、VEGF等基因的表达。结果表明，Ad-ING4-IL-24感染A549肺癌细胞后可获得成功转录和表达，体外联合组能明显抑制A549肺癌细胞生长和诱导细胞凋亡，呈现出典型细胞凋亡形态学变化。体内联合组同样能显著抑制肿瘤生长，瘤重抑瘤率达52.81%，免疫组化结果显示联合组能上调bax基因表达，同时下调bcl-2、VEGF等基因的表达。以上结果表明Ad-ING4-IL-24具有化疗增敏的作用，该作用机制可能与促进肿瘤细胞凋亡和抑制血管形成有关。

ING4，IL-24，顺铂，肺腺癌，化疗增敏

Abstract:To study the chemosensitivity and the mechanisms of recombinant adenovirus vector expressing ING4 and IL-24(Ad-ING4-IL-24) on lung adenocarcinoma in vitro and in vivo, the expression of ING4 and IL-24 in A549 cells was detected by RT-PCR and Western blotting. The growth inhibition, apoptosis rate and apoptosis body were measured by MTT, flow cytometry andHoechst staining respectively. For in vivo study, we first established the A549 tumor model by grafting A549 cells in athymic nude mice; and then injected Ad-ING4-IL-24 into the tumors. Two weeks after injection, we killed the mice, removed the tumors, weighted and calculated the ratios of tumor-suppression. We also detected the expressions of ING4, IL-24, bax, bcl-2, VEGF with immunohistochemistry. The results indicated that ING4 and IL-24 were proved successfully transcription and expression in A549 cells. More interestingly, the joint group inhibited the growth of A549 cells and induced apoptosis. The in vivo data showed that the joint group suppressed the tumor growth conspicuously through up-regulating the expression of bax, and down- regulating the expression of bcl-2, VEGF. The study proved that Ad-ING4-IL-24 significantly enhanced the chemosensitivity to anticancer drug DDP in lung adenocarcinoma, which may related with cell apoptosis and antiangiogenesis.

Keywords:ING4, IL-24, cisplatin (DDP), adenocarcinoma, chemosensitivity

近年来肺癌的总体发病率呈明显上升趋势，5年生存率仍为15%左右，无明显提高，严重威胁着人类的健康。目前对不适合手术切除的病人，使用细胞毒性药物的化学治疗就成为大部分肺癌患者的首选治疗方法[1]。尽管新的抗癌化疗药物不断推出，但是化疗对肺癌的治疗效果仍无显著提高，治疗失败的主要原因是肺癌细胞多药耐药性 (MDR) 的产生，为了克服肺癌细胞多药耐药性，寻求化疗增敏剂以提高疗效是较为有效的途径，但不少化疗增敏剂均因毒性太大或效果有限而遭淘汰，甘氨双唑钠(Sodium glyci –didazole，CM-Na) 是我国研制的新型硝基咪唑类乏氧细胞增敏剂。前期基础与临床研究证实：CM-Na能选择性提高肿瘤内乏氧细胞的放射敏感性，对食管癌、非小细胞肺癌 (Non-Small cell lung cancer, NSCLC) 等实体瘤放射增敏效果明显。其也有一定的化疗增敏作用，临床数据仍在积累过程中，但尚不能证明合用该药明显优于现有标准化疗及化放疗方法。因此，寻求高效低毒并能改善患者预后的化疗增敏剂任重道远。

目前，将血管内皮生长因子 (VEGF) 的单克隆抗体贝伐单抗 (Bevacizumab，Avastin) 与化疗药物联合应用的生物化疗手段，在晚期癌症的治疗中显示出良好的疗效。鉴于ING4[2]基因是近年来新发现的一种肿瘤抑制因子，属于生长抑制因子家族(Inhibitor of growth family，ING家族) 新成员，具有提高化疗药物敏感性的作用[3]，IL-24也具有抑制肿瘤细胞生长[4]和提高肺癌细胞化疗敏感性的作用[5]，已有研究表明[6]构建的 IL-24和 E1A双基因共表达腺病毒载体，作用于肝癌细胞后产生了更为显著的抑瘤作用，那么将IL-24和ING4两基因联合共表达能否对肺癌细胞起化疗增敏的作用？我们在成功构建 IL-24和 ING4双基因联合共表达载体(Ad-ING4-IL-24) 的基础上，观察了Ad-ING4-IL-24及与顺铂联合作用于 A549细胞及裸鼠移植瘤的化疗增敏效应的影响，并探讨了其分子生物学机制。

1 材料与方法

1.1 材料

人肺癌细胞株A549、QBI-293A细胞及携带GFP(绿色荧光蛋白) 的腺病毒空载体Ad、Ad-ING4-IL-24由苏州大学基础医学系细胞与分子生物学教研室提供；RPMI-1640、新生小牛血清购自杭州赛乐生物科技公司；RNA抽提试剂盒购自上海生工生物技术有限公司；MMLV逆转录酶、Taq DNA聚合酶购自MBI；IL-24、ING4基因引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列见表1；IL-24、ING4一抗购自美国abcam公司；二抗均购于碧云天生物技术研究所；四甲基偶氮唑蓝 (MTT) 购自美国Sigma公司；Annexin-v-PE/7-AAD凋亡试剂盒购于 Southern Biothech公司；Hoechst 染色试剂盒为南京凯基生物科技发展有限公司产品；顺铂 (DDP) 购自江苏连云港豪森制药有限公司；3~4周龄、体重18~20 g/只雄性BALB/C裸鼠购自中国科学院上海斯莱克实验动物中心[许可证号：SCXK(沪)2007-0005]；bcl-2、bax、VEGF抗体购自晶美公司。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primer used in this study

1.2 方法

1.2.1 IL-24和ING4双基因共表达腺病毒载体的构建

在苏州大学医学部细胞与分子生物学教研室构建的pAdTrack-IRES双基因共表达空载体的基础上，成功构建了 IL-24和 ING4双基因共表达腺病毒载体：首先在pAdTrack-CMV转移载体Sal I、Not I酶切位点间插入IRES片段，构建pAdTrack-CMV-IRES改造转移空载体；然后在pAdTrack-CMV-IRES改造转移空载体Xho I、Xba I酶切位点间插入IL-24片段；Bgl Ⅱ、Sal I酶切位点间插入ING4片段，分别构建 pAdTrack-CMV-IRES-IL-24、pAdTrack-CMVING4-IRES单基因重组转移载体；最后在pAdTrack-CMV-IRES-IL-24单基因重组转移载体Bgl Ⅱ、Sal I酶切位点间插入 ING4片段，构建 pAdTrack-CMVING4-IRES-IL-24双基因转移载体 (图1)，具体操作由苏州大学基础医学和生物科学学院细胞与分子生物学教研室谢宇锋老师完成。

1.2.2 Ad、Ad-ING4-IL-24腺病毒的扩增与效价的测定

通过Ad、Ad-ING4-IL-24感染 QBI-293A细胞获得重组病毒子扩增，具体操作步骤及效价测定按本科室常规方法进行[4]。

1.2.3 细胞培养与分组

采用常规培养，培养液为含 10%小牛血清的RPMI-1640。在37 ℃、饱和湿度、5% CO2温箱中培养，每1~2天换液传代。分别设以下5组：1) 阴性对照组 (PBS组)：0.1 mol/L PBS，2) 空载体对照组 (Ad组)：50 MOI Ad，3) 阳性对照组 (DDP组)：顺铂 DDP (终浓度为 25 μg/mL)，4) Ad-ING4-IL-24组：50 MOI Ad-ING4-IL-24，5) Ad-ING4-IL-24联合DDP (联合组)：50 MOI Ad-ING4-IL-24+DDP (终浓度为 12.5 μg/mL)。

1.2.4 ING4、IL-24在A549细胞中表达的鉴定

按上述分组处理A549细胞后，于37 ℃，5%CO2条件下培养48 h后在倒置显微镜及荧光显微镜下观察感染情况及细胞形态变化。

1000r/min离心收集上述各组细胞，PBS洗涤2~3次后，按总 RNA抽提试剂盒说明书操作提取RNA，用IL-24 (P3、P4) 和ING4 (P5、P6) 的引物进行RT-PCR。PCR的反应条件为：94 ℃ 4 min；94 ℃ 50 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30个循环；72 ℃延伸10 min。

同时收集上述各组细胞按 107细胞/mL比例加细胞裂解液 (含终浓度为1 mmol/L PMSF蛋白酶抑制剂) 进行裂解，充分裂解后12 000 r/min离心 5 min，取总蛋白上清进行蛋白变性，然后进行12% SDS-PAGE电泳，将蛋白转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶粉37 ℃封闭2 h；先后用羊抗人ING4抗体、鼠抗人IL-24抗体和HRP标记的驴抗羊和羊抗鼠的二抗孵育PVDF膜，DAB显色检测目的蛋白。

图1 ING4和IL-24双基因共表达模式示意图Fig. 1 Co-expression mode of ING4 and IL-24.

1.2.5 MTT法检测Ad-ING4-IL-24联合DDP对A549细胞生长的影响

将指数生长期的A549细胞，按1×105/mL的细胞浓度，于 96孔培养板每孔加 100 μL，37 ℃、5% CO2条件下培养24 h后，弃上清，按1.2.3分组进行实验，每组设 3个复孔，37 ℃、5% CO2条件下孵育，随后分别于1 d、2 d、3 d、4 d时加入MTT 10 μg/mL (5 mg/mL)，继续孵育 4 h后加入 10%SDS-HCl终止液 (100 μL/孔)，置于 37 ℃，至次日待甲臢结晶完全溶解后，在酶联免疫检测仪上测OD570值，以OD570值为纵坐标，时间为横坐标绘制生长曲线，并计算细胞生长抑制率。

生长抑制率= (对照组 OD570值−实验组 OD570值) /对照组OD570值×100%。

1.2.6 Annexin-V-PE/7-AAD双染FMC检测Ad-ING4-IL-24联合DDP对A549细胞凋亡的影响

取对数生长期的A549细胞，按1.2.3方法进行分组开展细胞凋亡的诱导实验，37 ℃、5% CO2条件下培养72 h后收集细胞，PBS清洗2次，用1×结合缓冲液调整细胞浓度至106~107个/mL，取100 μL细胞于流式管中，加10 μL Annexin-V-PE冰上混匀，避光 15 min。依次加入 380 μL 1×结合缓冲液和10 μL 7-AAD，上流式细胞仪检测。

1.2.7 激光共聚焦显微镜 (LSCM) 观察Ad-ING4-IL-24联合DDP对A549细胞的核形态学改变

在铺有玻片的六孔板中按5×104个/孔接种A549细胞，24 h后按上述分组处理细胞，再培养48 h后收获细胞悬液，用PBS洗2~3次，经4%多聚甲醛固定，Hoechst33258染色30 min，甘油封片后，在激光扫描共聚焦显微镜下观察细胞凋亡小体。

1.2.8 肺癌动物模型的建立

取对数生长期的 A549肺癌贴壁细胞，PBS洗涤，经0.25%胰酶消化，PBS洗涤2次，2 000 r/min离心5 min收获细胞，重悬于无血清的1640培养液中，调整细胞浓度达 4×107个/mL。取 30只 2~3周BALB/C雄性裸鼠，用安尔碘在其右前肢腋下消毒后皮下注射上述制备的A549肺癌细胞悬液100 μL(4×106个细胞/只)，在 SPF环境下饲养。隔日观察A549人肺癌细胞在裸鼠体内的生长和成瘤情况。

1.2.9 实验分组和抗肿瘤治疗

皮下接种2周待肿瘤直径长至约5 mm时，将其随机分成5组，每组6只，各组均使用瘤体内多点注射干预用药，PBS组用0.1 mL PBS，Ad组、Ad-ING4-IL-24组分别用0.1 mL (109PFU/mL) Ad和 Ad-ING4-IL-24，DDP组按 4 mg/kg剂量注射DDP，联合组注射 0.1 mL Ad-ING4-IL-24+DDP(2 mg/kg)，隔日1次，共6次。

1.2.10 检测指标及方法

用药前和用药后第 5、10、15、20天用游标卡尺分别测量皮下移植肿瘤的长径 (a)、短径 (b)，按公式计算瘤体体积 (V=ab2/2)，绘制肿瘤体积-时间变化曲线。治疗结束 1周后处死裸鼠，摘取瘤体并称重，计算各组抑瘤率。抑瘤率 (%) = (对照组肿瘤平均瘤重−治疗组肿瘤平均瘤重) /对照组肿瘤平均瘤重×100%。

1.2.11 免疫组化检测瘤体中各种因子的表达

肿瘤组织标本用10%中性甲醛固定过夜，常规石蜡包埋，用于进行免疫组化检测。采用抗体免疫组化SP染色后，以细胞质内和 (或) 细胞膜出现散在或弥漫状分布的棕黄色颗粒为阳性细胞，每张切片随机计数5个400倍视野，以每个视野所含阳性细胞数的平均值评价 ING4、IL-24、bax、bcl-2、VEGF蛋白的表达情况，取同组所有切片平均数进行统计学处理。

1.2.12 数据处理

联合组的化疗增敏效果判断用金正均法 (计算q 值)，q 值= E (A+B) / (EA+EB−EA·EB)，式中 EA、EB分别为A、B单用之效应，分子E (A+B) 代表实测合并效应，分母是期望合并效应。当q值=1±0.15时，两药间被认为有相加作用，q值＞1.15时，两药间被认为有协同作用，当 q＜0.85时，两药间有拮抗作用。

应用 SPSS 16.0 统计软件包进行数据处理，实验数据以均数±标准差 (±s) 表示，采用One-Way ANOVA分析，组间比较采用 LSD检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ING4、IL-24表达的鉴定

经多轮感染、扩增后，测定的病毒效价达109PFU/mL，用50 MOI剂量的病毒感染A549细胞，体外培养 72 h后 (图2)，Ad-ING4-IL-24作用的A549细胞出现变圆、脱落、皱缩等病变，Ad作用的A549细胞虽有轻度变圆，但无脱落、皱缩等病变，PBS组细胞贴壁生长状态良好，数量多，形态正常，DDP作用后的细胞圆缩脱落，细胞贴壁数量减少。RT-PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果显示，Ad- ING4-IL-24组和联合组在620 bp位置可检测到一条IL-24基因转录特异性条带，在750 bp位置可检测到一条 ING4基因转录特异性条带，而 PBS、Ad和DDP对照组中未出现预期条带 (图3)。Western blotting结果显示，Ad-ING4-IL-24组和联合组在相应位置产生了与抗ING4抗体和抗IL-24抗体结合的特异性条带，而PBS、Ad和DDP组则在相应位置未出现条带 (图 4)。结果表明腺病毒介导的外源性ING4、IL-24目的基因能在 A549细胞中成功进行mRNA转录和蛋白表达。

图2 Ad-ING4-IL-24联合DDP作用A549细胞的形态变化Fig. 2 Morphologic change of A549 cells transduced with Ad-ING4-IL-24 and combined with DDP. (A) Light microscope. (B)Fluorescence microscope.

图3 RT-PCR鉴定ING4、IL-24在A549细胞中的表达Fig. 3 Identification of ING4 and IL-24 in A549 cells by RT-PCR. M: DNA marker; 1: PBS group; 2: Ad group; 3: DDP group; 4: Ad-ING4-IL-24 group; 5: Ad-ING4-IL-24+DDP group.

图4 Western blotting鉴定ING4、IL-24在A549肺癌细胞中的表达Fig. 4 Expression of ING4 and IL-24 in A549 cells by Western blotting. 1: PBS group; 2: Ad group; 3: DDP group; 4:Ad-ING4-IL-24 group; 5: Ad-ING4-IL-24+DDP group.

2.2 MTT法检测 Ad-ING4-IL-24联合 DDP对A549细胞生长的抑制

MTT法检测发现，Ad-ING4-IL-24、DDP、联合组对A549细胞的生长有明显的抑制作用并呈时间依赖性 (图5)，其中第4天的生长抑制率 (图6) 分别为(56.94±2.14)%、(64.24±0.86)%和 (75.38±0.95)%，与细胞对照PBS组和Ad空载体腺病毒组比较呈显著性差异 (P＜0.05)。联合组的生长抑制作用明显优于 Ad-ING4-IL-24组和 DDP组 (P＜0.05)，呈现化疗增敏的相加效应 (q值=0.89)，而PBS组和Ad组无显著性差异 (P＞0.05)。

图5 Ad-ING4-IL-24联合DDP对A549细胞生长抑制作用曲线图Fig. 5 Growth inhibiting curve chart of A549 cells transduced with Ad-ING4-IL-24 and combined with DDP.

图6 Ad-ING4-IL-24联合DDP对A549细胞的生长抑制率Fig. 6 Growth inhibiting ratio of A549 cells transduced with Ad-ING4-IL-24 and combined with DDP.

2.3 Annexin-V-PE/7-AAD双染法 FMC检测Ad-ING4-IL-24联合 DDP对 A549细胞凋亡的影响

用 Annexin-V-PE/7-AAD双染流式细胞仪检测细胞凋亡 (图 7)。由图可见 Ad-ING4-IL-24、DDP和联合组均能诱导A549细胞凋亡，72 h早期平均凋亡 率 分 别 为 (30.67±2.69)% 、 (23.56±3.07)% 和(52.81±3.44)%，与 Ad空载体腺病毒组和细胞对照PBS组比较呈显著性差异 (P＜0.05)，其中联合组诱导 A549细胞凋亡的作用明显优于 Ad-ING4-IL-24组及 DDP组 (P＜0.05)，也呈现化疗增敏的相加效应 (q 值=1.12)。

图7 流式细胞术检测A549细胞凋亡率Fig. 7 Apoptosis rate of A549 cells detected by flow cytometry.

2.4 Ad-ING4-IL-24及其联合DDP诱导A549肺癌细胞凋亡的细胞核形态改变

用激光共聚焦显微镜观察细胞凋亡的核形态变化 (图8)，由图可见Ad-ING4-IL-24作用的A549细胞很多出现胞体固缩，核断裂，形成大小不等的块状或颗粒状的荧光碎片，即典型的凋亡小体，DDP组及Ad-ING4-IL-24联合DDP组的A549肺癌细胞核均出现深染、固缩，甚至断裂，呈现明显的细胞凋亡的核形态特征，而PBS、Ad空载体腺病毒处理的细胞核形态正常，未出现上述细胞凋亡的特征。

2.5 体内对人肺癌裸鼠移植瘤的抗肿瘤效应

图8 荧光显微镜观察A549细胞凋亡小体的形态学观察Fig. 8 Apoptotic body of A549 cells observed by LSCM.

图9 Ad-ING4-IL-24联合DDP对肺癌移植瘤的抑瘤效应Fig. 9 Inhibitory effect of lung cancer treated with Ad-ING4-IL-24 and combined with DDP. (A) The pictures of lung cancer. (B)The curves of tumor volume of lung cancer after treatment. (C) The inhibitory rate of tumor weight after treatment.

裸鼠皮下接种A549人肺癌细胞后，2周左右直径可达5 mm左右，成瘤率达100%。由图9A和图9B可见，Ad-ING4-IL-24、DDP和联合组对 A549裸鼠人肺癌移植瘤均有不同程度的抑制作用，与Ad组和 PBS组比较呈显著性差异 (P＜0.05)，联合组对裸鼠人肺癌移植瘤的体内抗肿瘤效应明显优于Ad-ING4-IL-24组及DDP组 (P＜0.05)。瘤重抑瘤率比较如图 9C所示，联合组的瘤重抑瘤率达(69.7±0.34)%，与 Ad-ING4-IL-24组 (56.58±0.3)%和DDP组 (46.47±4)%的抑瘤率相比具有统计学差异(P＜0.05)，对肺癌移植瘤的生长具有化疗增敏的相加作用 (q值=0.91)。而PBS组Ad组相比，无显著性差异 (P＞0.05)。

2.6 各组病理切片结果

2.6.1 瘤体切片ING4、IL-24蛋白的表达

免疫组化检测结果显示：Ad-ING4-IL-24组、联合组的ING4、IL-24阳性细胞数明显高于PBS组和Ad组，并呈强阳性表达(图10)。而PBS组、Ad组、DDP组为阴性或弱阳性表达。表明腺病毒介导的外源性ING4、IL-24目的基因能在肺癌移植瘤中获成功表达，同时也说明A549肺癌细胞本身 ING4、IL-24基因表达能力很弱或发生了缺陷，这种缺陷也可能与肺癌的发生有关。

2.6.2 瘤体切片bax、bcl-2、VEGF基因表达的检测结果

由图11可见，Ad-ING4-IL-24组、DDP组、联合组的bax阳性细胞数明显高于PBS组和Ad组(P＜0.05)，bcl-2、VEGF阳性细胞数明显低于 PBS组和Ad组 (P＜0.05)，而联合组明显优于Ad-ING4-IL-24组及DDP组 (P＜0.05)，PBS组和Ad组比较无显著性差异 (P＞0.05)。结果表明联合组能通过诱导肿瘤细胞凋亡和抑制血管生长等途径抑制裸鼠人肺癌移植瘤的生长。

3 讨论

长期以来化疗对晚期肺癌，尤其NSCLC疗效并不理想，含铂的联合化疗方案是肺癌化疗的主要方案，其效率一般在20%~48%之间[7]。效果仍不甚理想，主要原因在于肿瘤细胞的耐药性。因此，寻求高效低毒的化疗增敏剂及与细胞毒药物有协同抗肿瘤活性而少有毒副作用的药物是提高化疗有效率的主要研究方向之一。

2004年在Nature杂志上ING4基因正式被确定为一种重要的肿瘤生长抑制因子[8]。研究表明，ING4可通过多途径发挥特异性抗肿瘤效应，靶向诱导肿瘤细胞凋亡，是一种潜在的新型抑癌基因，Zhang等[3]建立了几个稳定表达 ING4的肝癌细胞系(HepG-2)，发现ING4能明显抑制HepG-2细胞生长，提高肝癌细胞对 DNA损伤试剂 (如鬼臼乙叉甙和阿霉素) 的化学敏感性。白细胞介素24(IL-24) 作为一种抑癌基因，起初是在人类黑色素瘤细胞[9]中诱生而获得的。研究表明，IL-24不仅能特异抑制多种肿瘤细胞生长、抑制肿瘤血管形成[10]和靶向诱导肿瘤细胞凋亡，而且还能提高化疗和放疗对肿瘤的敏感性[11-13]。

本研究采用 MTT和 FCM 检测结果表明，Ad-ING4-IL-24联合DDP化疗药物可抑制A549肺癌细胞生长和诱导凋亡，明显优于 Ad-ING4-IL-24组及DDP组，体内对肺癌裸鼠移植瘤的生长抑制作用和诱导凋亡作用也明显优于 Ad-ING4-IL-24组及DDP组，具有化疗增敏的相加效应。MDR产生的机理较复杂，普遍认为肿瘤细胞凋亡抵抗是产生多药耐药性的主要机制之一。大多数肿瘤化疗药物是通过诱导肿瘤细胞凋亡而发挥抗肿瘤作用的。Bc1-2是凋亡抑制基因。有研究发现 bc1-2的过度表达与瘤细胞中的耐药基因的表达相关联，并可通过抑制细胞凋亡而导致耐药性的发生[14]。Bax是促进细胞凋亡的基因，bc1-2与bax在体内是通过二聚体而发挥作用的，bax / bc1-2下降，抑制凋亡，bax / bc1-2升高，促进凋亡。本研究结果示联合组的 bax蛋白表达明显上调，而 bcl-2蛋白表达明显下降，bax /bc1-2升高。因此，Ad-ING4-IL-24通过上调bax和下调 bcl-2表达来诱导肿瘤细胞凋亡可能是Ad-ING4-IL-24化疗增敏的重要机制之一。

图10 免疫组化检测瘤体中ING4、IL-24蛋白的表达Fig. 10 Expression of ING4 and IL-24 in lung cancer.

图11 免疫组化法检测瘤体中各种因子的表达变化Fig. 11 Expression change of cytokines in lung cancer.

近年来化疗与抗血管生成药的联合应用也越来越多，抗血管生成疗法已成为癌症化疗增敏的新策略[15]。贝伐单抗为血管内皮细胞生长因子 (VEGF)的人源单抗。联合贝伐单抗的化疗方案在美国及许多其他国家已获准作为结直肠癌的一线治疗[16]。此联合贝伐单抗治疗方法在乳腺癌及非小细胞肺癌的Ⅲ期临床试验也同样显示了较为理想的结果。研究显示联合组的VEGF阳性细胞数明显低于Ad-ING4-IL-24组与DDP组，提示Ad-ING4-IL-24抑制VEGF的表达从而抑制肿瘤血管生成，可能是Ad-ING4-IL-24化疗增敏的又一途径。

综上所述，本研究结果表明 Ad-ING4-IL-24能提高人肺腺癌细胞及移植瘤对DDP的化疗敏感性，即具有化疗增敏作用。

REFERENCES

[1] Chu DT. The Evaluation of Current Therapeutic Regimens of Medical Oncology. Beijing: Peking University Medical Press, 2004: 289.

储大同. 当代肿瘤内科治疗方案评价. 北京: 北京大学医学出版社, 2004: 289.

[2] Kim S, Chin K, Gray JW, et al. A screen for genes that suppress loss of contact inhibition: identification of ING4 as a candidate tumor suppressor gene in human cancer.Proc Natl Acad Sci USA, 2004, 101(46): 1625l−16256.

[3] Zhang X, Xu LS, Wang ZQ, et al. ING4 induces G2/M cell cycle arrest and enhances the chemosensitivity to DNA-damage agents in HepG2 cells. FEBS Lett, 2004,570(1/3): 7−12.

[4] Shan YB, Sheng WH, Yang JC, et al. Adenovirus mediated IL-24 gene expression inhibits growth of human glioma cell in vitro. Chin J Biotech, 2009, 25(2): 279−286.

单云波, 盛伟华, 杨吉成, 等. Ad-IL-24对人胶质瘤细胞生长抑制效应的体外实验. 生物工程学报, 2009,25(2): 279−286.

[5] Emdad L, Lebedeva IV, Su ZZ, et al. Melanoma differentiation associated gene-7/interleukin-24 reverses multidrug resistance in human colorectal cancer cells. Mol Cancer Ther, 2007, 6(11): 2985−2994.

[6] Wang XH, Miao JC, Xie YF, et al. Construction of adenovirus vector expressing IL-24 and E1A and its inhibition of SMMC-7721. Chin J Biotech, 2009, 25(7):1035−1041.

汪小华, 缪竞诚, 谢宇锋, 等. 腺病毒介导IL-24-ElA双基因载体的构建及其体外抑制SMMC-7721肝癌细胞生长作用初探. 生物工程学报, 2009, 25(7): 1035−1041.

[7] Lübbe AS, Alexion C, Bergemann C. Clinical application of magnetic drug targeting. J Surg Res, 2001, 95(2):200−206.

[8] Garkavtsev I, Kozin SV, Chernova O, et al. The candidate tumour suppressor protein ING4 regulates brain tumour growth and angiogenesis. Nature, 2004, 428(6980):328−332.

[9] Jiang H, Lin JJ, Su ZZ, et al. Subtraction hybridization identifies a novel melanoma differentiation associated gene, mda-7, modulated during human melanoma differentiation, growth and progression. Oncogene, 1995,11(12): 2477−2486.

[10] Inoue S, Branch CD, Gallick GE, et al. Inhibition of Src kinase activity by Ad-mda7 suppresses vascular endothelial growth factor expression in prostate carcinoma cells. Mol Ther, 2005, 12(4): 707−715.

[11] Huang EY, Madireddi MT, Gopalkrishnan RV, et al.Genomic structure, chromosomal localization and expression profile of a novel melanoma differentiation associated (mda-7) gene with cancer specific growth suppressing and apoptosis inducing properties. Oncogene,2001, 20(48): 7051−7063.

[12] Emdad L, Lebedeva IV, Su ZZ, et al. Melanoma differentiation associated gene-7/interleukin-24 reverses multidrug resistance in human colorectal cancer cells. Mol Cancer Ther, 2007, 6(11): 2985−2994.

[13] Yacoub A, Mitchell C, Lister A, et al. Melanoma differentiation-associated 7(interleukin 24) inhibits growth and enhances radiosensitivity of glioma cells in vitro and in vivo. Clin Cancer Res, 2003, 9(9): 3272−3281.

[14] Tse C, Shoemaker AR, Adickes J, et al. ABT-263: a potent and orally bioavailable Bcl-2 family inhibitor. Cancer Res,2008, 68(9): 3421−3428.

[15] Kerbel RS. Antiangiogenic therapy: a universal chemosensitization strategy for cancer? Science, 2006,312(5777): 1171−1175.

[16] Ma J, Waxman DJ. Combination of antiangiogenesis with chemotherapy for more effective cancer treatment. Mol Cancer Ther, 2008, 7(12): 3670−3684.

[10] Paesano R, Torcia F, Berlutti V, et al. Oral administration of lactoferrin increases hemoglobin andtotal serum iron in pregnant women. Biochem Cell Biol, 2006, 84(3):377−380.

[11] Liang QW, Richardson T. Expression and characterization of human lactoferrin in yeast Saccharomyces cerevisiae. J Agric Food Chem, 1993, 41(10): 1800−1807.

[12] Zhang J, Li L, Cai Y, et al. Expression of active recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic goats. Protein Expr Purif, 2008, 57: 127−135.

[13] Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T. Molecular Clonging: A Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.

[14] Zhao MT, Lin H, Liu FJ, et al. Efficiency of human lactoferrin transgenic donor cell preparation for SCNT.Theriogenology, 2009, 71: 376−384.

[15] He ZY, Yu SL, Li N, et al. Maternally transmitted milk containing recombinant human catalase provides protection against oxidation for mouse offspring during lactation. Free Radical BIO MED, 2008, 45: 1135−114.

[16] Zhang YL, Wan YJ, Wang F, et al. Production of dairy goat embryos, by nuclear transfer, transgenic for human acid β-glucosidase. Theriogenology, 2010, 73(5): 681−690.

[17] Robert E, Rhoads, Ewa GN. Translational regulation of milk protein synthesis at secretory activation. J Mammary Gland Bio Neoplasia, 2007, 12: 283−292.

[18] Cao Y, Gao HY, Yu L, et al. Studies of the clone and cell expression of human lactoferrin gene. Hereditas, 2002,24(1): 9−14.

曹阳, 高华颖, 于黎, 等. 人乳铁蛋白基因克隆及细胞表达研究. 遗传, 2002, 24(1): 9−14.

[19] Van Berkel PH, Welling MM, Geerts M, et al. Large scale production of recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic cows. Nat Biotechnol, 2002, 20(5): 484−487.

[20] Yang PH, Wang JW, Li N, et al. Cattle mammary bioreactor generated by a novel procedure of transgenic cloning for large-scale production of functional human Lactoferrin. PLoS One, 2008, 3(10): e3453.

Effect of adenovirus-mediated ING4 and IL-24 co-expression on chemosensitivity to human lung adenocarcinoma in vitro and in vivo

Yehan Zhu1, Xianrong Du1, Huaxin Chen1, Yufeng Xie2, Weihua Sheng2, and Jicheng Yang2
1 Department of Respiratory of the First Affiliated Hospital in Soochow University, Suzhou 215006, China
2 Molecular Biology Institute, College of Medicine, Soochow University, Suzhou 215123, China

Received: June 3, 2010; Accepted: September 25, 2010

Supported by: National Major Special Program of Breeding of Transgenetic Organisms New Variety (No. 2008ZX08008-004), The Opening Project of Animal Reproduction and Molecular Design Laborary of Jiangsu Province (No. YDKT0801).

Corresponding author: Feng Wang. Tel: +86-25-84395381; Fax: +86-25-84395314; E-mail: caeet@njau.edu.cn

国家“转基因生物新品种培育”重大专项 (No. 2008ZX08008-004)，江苏省动物繁育与分子设计实验室开放课题 (No. YDKT0801) 资助。