雌激素受体关联受体α调节脂肪细胞甘油三酯分解

鞠大鹏，何晶晶，郑雪莉，赵丽丽，杨公社

西北农林科技大学动物科技学院 动物脂肪沉积与肌肉发育实验室，杨凌 712100

雌激素受体关联受体α调节脂肪细胞甘油三酯分解

鞠大鹏，何晶晶，郑雪莉，赵丽丽，杨公社

西北农林科技大学动物科技学院 动物脂肪沉积与肌肉发育实验室，杨凌 712100

雌激素受体关联受体α (Estrogen-related receptor α，ERRα) 是调控机体能量代谢的关键转录调控因子，也是脂肪生成的关键调控者。为研究ERRα对脂肪细胞甘油三酯分解的影响及其分子机制，分化的猪脂肪细胞在PKA (Protein kinase A) 或/和ERK (Extracellular signal-related kinase) 抑制剂预处理和不处理的情况下，再用Ad-ERRα侵染或XCT790处理48 h。通过测定脂肪细胞中甘油三酯浓度和培养液中的甘油释放量分析脂肪细胞的脂解变化；Western blotting方法检测 PPARγ (Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)、perilipin A、p-perilipin A、HSL (Hormone sensitive lipase，HSL) 和ATGL (Adipose triglyceride lipase，ATGL) 蛋白表达。结果显示，ERRα显著促进猪脂肪细胞分化及甘油三酯积累，同时促进了甘油三酯水解；分别及同时阻断PKA和ERK通路并不影响ERRα对脂肪细胞甘油释放的促进作用；ERRα显著上调HSL、ATGL、PPARγ及perilipin A蛋白表达，但p-perilipin A水平并未发生变化。推测过量表达 ERRα可能导致 HSL和 ATGL蛋白表达上调并促进甘油三酯水解，从而为脂肪细胞分化提供更多的游离脂肪酸(Free fat acid，FFA) 作为甘油三酯合成周转的底物。

猪，ERRα，甘油三酯水解，脂肪细胞

Abstract:Estrogen-related receptor α (ERRα) is a key regulator for energy metabolism and adipogenesis. However, its role in lipolysis is unknown. To study the function of ERRα in lipolysis, primary cultured differentiated porcine adipocytes were treated by a specific inverse agonist XCT790 or infected with adenoviral vector expressed ERRα for 48 h, in the absence and/or presence of specific protein kinase A (PKA) inhibitor or extracellular signal-related kinase (ERK) inhibitor. Then, we measured the triglyceride (TG) content and the glycerol release into the culture media to analysis the effect of ERRα on lipolysis; Further, we analyzed the expression of PPARγ, perilipin A, p-perilipin A, HSL and ATGL with Western blotting. Here, we found that ERRα significantly increased adipocytes differentiation, TG accumulation and glycerol release. Separately or simultaneously block the PKA and ERK pathway do not significantly altered the effect of ERRα on glycerol release. ERRα significantly up-regulated the proteins expression of PPARγ, perilipin A, HSL and ATGL, while the p-perilipin A protein level was not significantly changed.These findings imply that ERRα could increase lipolysis via up-regulating HSL and ATGL, thereby to supply more FFA as substrate for a larger turnover of cellular triglyceride pool during adipocytes differentiation.

Keywords:pig, estrogen-related receptor α (ERRα), lipolysis, adipocytes

雌激素受体关联受体 α (Estrogen-related Receptor α，ERRα) 是最早被鉴定出的核激素受体之一[1]。大量研究表明，ERRα高表达于线粒体含量丰富的组织中，具有促进线粒体生成及调节能量代谢相关基因表达的作用[2-3]，此外，最近有研究者发现ERRα很可能在调控脂肪细胞甘油三酯积累过程中发挥重要作用[4-5]。与此结果相一致的是，我们在前期的研究中也发现抑制 ERRα蛋白表达能够减少脂肪细胞中甘油三酯积累[6]，然而这种结果与脂肪细胞分化及甘油三酯水解的关系尚不清楚。与啮齿类动物相比，猪的体脂沉积较多，且在生理特性方面与人类有诸多相似之处，是研究人类肥胖及代谢相关疾病的重要医学模型[7]。

本研究利用携带 ERRα基因的腺病毒及 ERRα特异性抑制剂 XCT790[8]处理原代培养的分化的猪脂肪细胞，探讨 ERRα对猪脂肪细胞脂解的作用及其分子机制，为进一步研究 ERRα对脂肪细胞脂代谢的作用奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及材料

实验动物：1~3日龄健康长白仔猪由西北农林科技大学种猪场提供，体重 1.5~2.5 kg，取样前用0.5%的新洁尔灭清洗0.5 h，电击处死。

实验材料：HEK293细胞系购于中国科学院上海细胞生物学研究所。BJ5183菌株、穿梭质pAdTrack-CMV和腺病毒基因组质粒 pAdeasy-1均为西北农林科技大学动物脂肪沉积与肌肉发育实验室保存。

1.2 主要试剂

Taq酶和限制性内切酶PmeⅠ、PacⅠ、XbaⅠ、Hind Ⅲ、CIAP (Alkaline Phosphatase，CIAP) 均购于NEB公司，琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、ultra-Pfu高保真Taq 酶购于Bioflux公司，普通Taq DNA聚合酶购于 Fermentas公司，质粒大提试剂盒购于Omega公司，DMEM/F12、Ⅰ型胶原酶购于 Gibco公司，无酚红的DMEM培养基购于Hyclone公司，胎牛血清购于杭州四季青公司，脂质体LipofectamineTM2000购自 Invitrogen公司，ERRα特异性抑制剂XCT790购于Sigma公司，PKA通路抑制剂 H89、ERK通路抑制剂 PD98059、ERRα一抗 (Anti-goat)、perilipin A 一抗 (Anti-goat)、β-actin一抗 (Anti-mouse)、PPARγ一抗 (Anti-goat) 购于Santa Cruz公司，磷酸化PKA底物一抗 (Anti-rabbit，用于检测 p-perilipin A) HSL一抗 (Aiti-rabbit) 和ATGL一抗 (Anti-rabbit) 购于CST公司，甘油及甘油三酯检测试剂盒购于北京普利莱基因技术有限公司，其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.3 ERRα腺病毒超表达载体的构建、病毒包装及滴度测定

1.3.1 带酶切位点猪ERRα基因全长开放阅读框(Open reading frame，ORF) 序列获得

猪ERRα基因全长ORF序列由本实验室克隆获得[6]。在此引物基础上设计上游带Hind Ⅲ酶切位点和下游带 XbaⅠ的引物 (表 1)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以获得的猪 ERRα基因全长 ORF序列为模板，按照 ultra-Pfu高保真 Taq酶说明书进行PCR 扩增。PCR反应程序如下：95 ℃ 6 min; 94 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，72 ℃ 105 s，30个循环; 72 ℃ 10 min; 4 ℃ 30 min。

表1 Touch down PCR引物Table 1 PCR primer

1.3.2 ERRα重组腺病毒表达载体构建

将上述PCR产物和CMV空载体分别用XbaⅠ和Hind Ⅲ双酶切，琼脂糖凝胶电泳后用DNA回收试剂盒回收，T4 DNA连接酶16 ℃过夜连接。连接产物氯化钙法转化E. coli DH5α感受态细菌，转化的菌液均匀涂布于含100 μg/mL卡那霉素的LB平板上进行筛选，适时挑取单克隆摇菌，按照质粒抽提试剂盒说明书小量提取质粒，经XbaⅠ、Hind Ⅲ双酶切和 PCR鉴定后，将获得的阳性克隆质粒 (即pAdTrack-ERRα) 送上海生工生物技术服务有限公司测序。获得pAdTrack-ERRα的质粒DNA经过PmeⅠ线性化和CIAP去磷酸化，转化已转入pAdEasy-1的感受态BJ5183菌发生同源重组。重组质粒经过PacⅠ酶切和 PCR鉴定后，将正确的重组质粒命名为Ad-ERRα。质粒转化 DH5α感受态菌扩大培养，经去内毒素的质粒大提试剂盒提取重组质粒备用。

1.3.3 病毒包装及滴度测定

将Ad-ERRα质粒转化至DH5α感受态菌中扩大培养，去内毒素质粒大提试剂盒提取质粒后，PacⅠ酶切线性化 Ad-ERRα并利用乙醇沉淀收集质粒。LipofectaminTM2000携带线性化的 Ad-ERRα转染HEK293细胞进行包装，观察细胞内报告基因 GFP(Green fluorescent protein，GFP) 的表达及细胞的病变效应 (Cytopathic effect，CPE) 情况，并于转染后第5天发生完全病变时收集上清作为病毒原液。随后利用病毒原液反复感染HEK293细胞，扩增病毒。当扩增至10个T25-Flask时，于病毒侵染24 h内收集细胞并悬浮2 mL PBS中，液氮和37 ℃水浴反复冻融5次后，12 000 r/min离心10 min收集病毒上清并于−80 ℃保存待用。

采用重复性较高的半数组织培养感染剂量(Tissue-culture infectious dose 50，TCID50) 法测定重组腺病毒Ad-ERRα的滴度并根据Karbers公式计算病毒滴度。滴度 T=10×101+d(s−0.5)TCID50/mL。其中d=lg稀释度=1 (对于10倍的稀释度而言)；s=阳性比率之和(从第一个10倍比稀释度算起)。并根据以下公式，换算成PFU/mL，单位：T=1×10xTCID50/mL=1×10x–0.7PFU/mL。

1.4 原代猪脂肪细胞分离培养及诱导分化

无菌条件下采集仔猪颈背部皮下脂肪组织，用Ⅰ型胶原酶消化法分离猪前体脂肪细胞[9]，以5×104细胞/cm2的密度接种于直径 60 mm 的培养皿，加适量含 10%胎牛血清的 DMEM/F12培养液，置于 37 ℃、饱和湿度、5% CO2的培养箱培养。接种当天记做第0天，以后每48 h更换1次培养液，细胞融合率至95%左右时更换为分化诱导培养基 (胰岛素5 μg/mL) 诱导前体脂肪细胞分化，直至80%以上的前体脂肪细胞充脂分化并形成具有明显的大脂滴后进行处理，用于研究 ERRα在脂肪细胞脂解中的作用。

1.5 甘油含量测定

用甘油检测试剂盒测定脂肪细胞培养液中的甘油浓度作为脂解率指标，操作方法严格按照试剂盒说明书执行。测量结果经各组总蛋白浓度标准化后，以空对照组甘油释放量的倍数表示。

1.6 Western blotting检测ERRα、HSL、ATGL、PPARγ、perilipin A和p-perilipin A蛋白表达

细胞总蛋白提取：根据本实验室已建立的方法[10]，提取细胞总蛋白。考马斯亮蓝法定量后，根据定量结果，利用上样缓冲液将不同组织蛋白的浓度调成一致，100 ℃沸水中煮5 min后，70 ℃保存。

蛋白电泳：取蛋白样品50 μg上样，以80 V电压在12% SDS-PAGE中分离约2 h后，转移至PVDF膜上。

蛋白免疫印迹及蛋白表达分析：5% BSA室温封闭 2 h，一抗(ERRα、HSL、ATGL、PPARγ、perilipin A和磷酸化PKA底物均为1：300)室温孵育2 h，二抗 (羊二抗均为1∶3 000，鼠二抗和兔二抗均为1∶4 000) 室温孵育2 h，ECL发光并利用Bio-Rad公司的化学发光仪 ChemiDocXRS+检测蛋白表达变化。曝光后，利用Quantity one软件分别计算各条带与β-actin条带吸光度的比值，即各蛋白表达量以目的蛋白吸光值与β-actin的吸光值的比值表示。处理组各蛋白的相对表达量以对照组的倍数表示。

1.7 甘油三酯含量测定及油红O染色

超声波法裂解细胞，收集上清。参照甘油三酯检测试剂盒说明书，测定脂肪细胞中甘油三酯含量，并利用蛋白浓度对其含量进行标准化。油红O染色参照实验室已建立的方法[11]进行操作。

1.8 统计分析

2 结果

2.1 猪pAdTrack-CMV-ERRα穿梭载体及重组腺病毒Ad-ERRα的鉴定

构建的 pAdTrack-CMV-ERRα穿梭载体进行Hind Ⅲ和XbaⅠ双酶切，得到大小为1 269 bp和9 220 bp 2个片段 (图1A)，说明穿梭载体构建成功。pAdTrack-CMV-ERRα经测序鉴定后，PmeⅠ酶切线性化并与骨架载体 pAdEasy-1进行重组。重组的腺病毒载体经 PacⅠ酶切后，0.8%琼脂糖凝胶电泳如显示出1条大片段 (约30 kb) 及1条小片段 (约3.0或4.5 kb)，则可确定为阳性克隆。本试验中重组腺病毒载体Ad-ERRα经PacⅠ酶切后电泳，可观察到1 条大的DNA片段 (约30 kb) 和1条较小的DNA片段 (4.5 kb) (图1B)，表明是阳性克隆。

图1 pAdTrack-ERRa和pAd-ERRα的鉴定Fig. 1 Identification of recombinant pAdTrack-ERRa and recombinant Ad-ERRa. (A) pAdTrack-ERRa was identified by restriction enzyme digestion (Xba I and Hind Ⅲ ). (B) pAd-ERRa was identified by restriction enzyme Pac I digestion. M:DNA marker.

2.2 重组腺病毒的包装及滴度测定

经PacⅠ酶切线性化的 Ad-ERRα转染 HEK293细胞。Ad-ERRα转染的HEK293细胞 24 h后 GFP开始表达 (图2A)。转染后48 h GFP的表达急剧升高，荧光数量显著增加 (图2B)。转染后72 h后，细胞肿胀、变圆、皱缩。同时，释放到培养液上清中的腺病毒开始并感染周围的细胞 (图2C)，随着时间的延长，整个视野荧光数会逐渐增多。转染后96 h，95%以上的细胞出现了CPE变化。收集的重组腺病毒原液经扩增后 (图 2D)，用 TCID50法测定病毒滴度，滴度达到了9×108PFU/mL。

2.3 猪脂肪细胞中ERRα蛋白表达的调控

为研究ERRα对脂肪细胞脂解及分化的影响，我们拟采用Ad-ERRα及其特异性抑制剂XCT790调节其蛋白表达量。Ad-ERRα (MOI=20) 侵染及10 μmol/L XCT790[6]处理分化的脂肪48 h后，收集细胞总蛋白进行Western blotting检测。结果显示，与对照组相比，Ad-ERRα显著上调了ERRα蛋白1.7倍，而XCT790下调 ERRα蛋白 0.5倍 (图 3)。表明 Ad-ERRα(MOI=20) 及10 μmol/L XCT790能够在脂肪细胞中有效地调控ERRα蛋白表达。

图2 重组腺病毒Ad-ERRα的包装和扩繁Fig. 2 Ad-ERRα virus production and harvest. HEK293 cells were transfected with Ad-ERRα. GFP expression was recorded at 24 h (A), 48 h (B) and 72 h (C) post transfection. (D)Ad-ERRα virus infect HEK293 cells.

图3 Ad-ERRα及XCT790在分化的猪脂肪细胞中调控ERRα蛋白表达Fig. 3 Regulations of ERRα protein expression in differentiated porcine adipocytes by Ad-ERRα virus and XCT790.Differentiated porcine adipocytes were infected with Ad-ERRα(or Ad-GFP) or treated with XCT790 (or DMSO) for 48 h.Whole cell protein were extracted and subjected to Western blotting with ERRα and β-actin antibodies. The relative expression level of ERRα protein among different treatment was analyzed. Different letters show significant differences(P<0.05).

2.4 ERRα促进脂肪细胞甘油三酯积累及甘油释放

实现在猪脂肪细胞中调节ERRα蛋白表达后，进一步分析了其对脂肪细胞甘油三酯积累和甘油三酯水解的影响。与我们之前结果相一致，Ad-ERRα处理组细胞甘油三酯含量为其对照的1.5倍，而XCT790处理组的甘油三酯含量仅为其对照组的 40% (图4A)。进一步甘油释放量分析发现，Ad-ERRα处理组细胞甘油释放量为其对照的1.2倍，而XCT790处理组的甘油释放量为其对照组的 80% (图 4B)。以上结果表明，尽管 ERRα促进了脂肪细胞中甘油三酯积累，但同时增加了脂肪细胞中脂肪水解。

2.5 PKA通路及ERK通路不参与调控ERRα促进的脂肪细胞甘油释放

图4 ERRα调控分化的脂肪细胞中甘油三酯积累及水解Fig. 4 ERRα Regulate TG accumulation and lipolysis in differentiated porcine adipocytes by Ad-ERRα virus and XCT790. Differentiated porcine adipocytes were treated as described in Fig.3. The culture medium was collected for glycerol release determination. Cells were collected for TG concentration measurement. Different letters show significant differences (P<0.05).

脂肪细胞甘油三酯水解不仅受脂解酶以及脂解阻碍蛋白perilipin A的调控，脂解通路也发挥着重要的作用。其中，PKA[12]通路和ERK[13]通路是目前研究最为清楚的两条脂解通路。我们接下来分析了这两条通路在 ERRα促进的脂解中的作用。结果显示，无论同时阻断两条通路或阻断其中任意一条通路后，均不能影响 ERRα诱导的甘油三酯水解 (图5)。由此表明 PKA通路及 ERK通路不参与调控ERRα促进的脂肪细胞甘油释放。

图5 H89及PD98059不影响ERRα对脂解的促进作用Fig. 5 H89 and PD98059 do not change the ERRα stimulated lipolysis. Differentiated porcine adipocytes were pretreated with H89 and PD98059 separately or simultaneously for 48 h. Then were cultured for another 48 h at the present or absent of Ad-ERRα. Cell culture medium was collected for glycerol determination. *P<0.05 compared with the group without Ad-ERRα infection.

2.6 ERRα调控HSL、ATGL、PPARγ及perilipin A蛋白表达

由于PKA及ERK通路并不参与调控ERRα介导的脂肪水解，因此对脂解装置，如脂解酶和脂滴包被蛋白的表达进行了检测。结果显示，Ad-ERRα显著上调了分化标志蛋白PPARγ和perilipin A的表达 (图 6)。表明 ERRα能够促进脂肪细胞分化。同时，脂解酶 HSL和 ATGL表达量也显著上调，而p-perilipin A表达量并未发生明显变化 (图6)。表明，过表达 ERRα所导致的脂解增加，很可能是通过调控脂解酶的表达而实现的。

3 讨论

图6 ERRα调节HSL、ATGL、PPARγ及perilipin A蛋白表达Fig. 6 ERRα regulates the protein expression of HSL, ATGL,PPARγ and perilipin A. Differentiated porcine adipocytes were treated as described in Fig. 3. Whole cell protein were extracted and subjected to western blotting with HSL, ATGL, PPARγ,perilipin A, p-perilipin A and β-actin antibodies. The relative expression level of ERRα protein among different treatment was analyzed. Different letters show significant differences(P<0.05).

ERRα是机体能量代谢网络中的关键调控因子。在高能量消耗组织中，ERRα能够通过调控线粒体的生物合成、氧化磷酸化以及脂肪酸的 β-氧化途径影响机体的能量平衡[2-3]，而其在脂肪组织中的作用一直被人们忽视。直到 ERRα基因敲除鼠模型的产生[14]，人们才认识到ERRα在脂肪形成中具有重要作用，从而拉开了研究其在脂肪组织中生理作用的序幕。尽管目前已经发现 mERRα随脂肪细胞分化表达量增加[4]，并且与甘油三酯积累量正相关[5]，但其在脂解中的作用及机制尚不清楚。在成功地利用腺病毒表达载体及其特异性抑制剂 XCT790实现对ERRα蛋白表达调控的基础上，我们探讨了其在脂肪细胞甘油三酯水解中的作用及机制。

与我们先前的结果相互支持的是[6]，过表达ERRα能够促进了脂肪细胞中甘油三酯的积累。而在此过程中，对脂肪细胞分化具有决定性调控作用的转录因子PPARγ表达受到了ERRα的调控，而起作用机制及其与脂肪细胞分化的关系尚有待进一步研究。脂肪细胞中甘油三酯的含量是其合成和分解动态调节的结果，当甘油三酯合成的速度大于脂解时便会产生甘油三酯的积累。而在脂肪细胞积累甘油三酯的过程中，脂解的变化可能存在2种方式。其一，脂解作用减弱，促进甘油三酯积累。其二，为满足甘油三酯合成所需要大量的 FFA，脂肪细胞除通过吸收培养基中的FFA以外，还通过分解自身合成的甘油三酯[15]。然而，这两种作用是否发生在Ad-ERRα促进的脂肪细胞分化中尚不清楚。

众多文献表明，ERRα在分化的脂肪细胞中很可能是抑制甘油三酯水解的。Luo等[14]和Kutoh等[16]发 现 ，ERRα 能 够 结 合 在 β3-AR (β3-adrenergic receptor，β3-AR) 基因启动子区域，而ERRα基因敲出鼠β3-AR基因表达上升1.7倍，暗示ERRα很可能通过下调β3-AR基因表达而抑制PKA通路的脂解活性。Perilipin A (Perilipin家族的主要成员)作为脂滴膜上保护蛋白[17]，是多条脂解通路的终末靶点[17-18]，对脂肪分解具有关键的调控作用。研究发现，ERRα能够转录激活 perilipin A的启动子活性[19]，表明ERRα很可能能通过调节perilipin A的活性影响脂肪细胞甘油三酯水解。综合考虑过表达 ERRα促进了脂肪细胞中甘油三酯的积累，推测 ERRα很可能在脂肪细胞中抑制甘油三酯水解。然而，我们在过表达 ERRα后发现脂肪细胞的甘油释放量是显著增加的。为了解释这种现象，我们首先分析了脂肪细胞中的主要脂解通路，即PKA和ERK通路在此过程中的作用。由于这两条通路能够独立或协同影响脂解[20]，因此在分别或同时阻断这两条后，检测了ERRα的脂解效应。结果显示，这两条通路均不参与调控 ERRα介导的脂解作用；接下来，进一步分析了perilipin A的表达变化。结果显示，Ad-ERRα显著上调perilipin A的表达，而其磷酸化水平并未发生改变，表明perilipin A并不参与调控此升高的脂解过程；最后，对脂解酶的表达量进行的检测发现，HSL和 ATGL的表达量受到显著上调，表明ERRα介导的脂解作用是通过上调这两种酯酶实现的。研究揭示，PPARγ能够直接调控HSL[21]和ATGL[22]蛋白的表达。本研究中，Ad-ERRα显著上调PPARγ、HSL和ATGL蛋白表达，由此推断，PPARγ表达水平的升高直接导致了HSL和ATGL蛋白的表达水平的上升。

综上所述，本研究首次探讨了 ERRα对脂肪细胞甘油三酯水解的影响，初步揭示了 ERRα调控甘油三酯水解的分子机理。本研究将为有效调控动物体脂沉积、防治人类脂代谢相关疾病提供新的靶点和理论参考。

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Role of estrogen-related receptor α in adipocyes lipolysis

Dapeng Ju, Jingjing He, Xueli Zheng, Lili Zhao, and Gongshe Yang
Laboratory of Animal Fat Deposition and Muscle Development, College of Animal Science and Technology, Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry, Yangling 712100, China

Received: March 18; Accepted: June 22, 2010

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 30472158).

Corresponding author: Dexiu Zhao. Tel: +86-10-62836201; E-mail: zhaodx@ibcas.ac.cn国家自然科学基金 (No. 30472158) 资助。