绿色荧光蛋白转基因小鼠的生理生化常数

贺晓玉，何 君，徐艳峰，秦 超，高 虹

(中国医学科学院医学实验动物研究所 北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

绿色荧光蛋白转基因小鼠的生理生化常数

贺晓玉，何 君，徐艳峰，秦 超，高 虹

(中国医学科学院医学实验动物研究所 北京协和医学院比较医学中心卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021)

目的 测定绿色荧光蛋白转基因小鼠不同年龄段的生理生化、组织病理学等方面的指标，为该品种转基因小鼠应用于毒理学等领域研究提供理论依据。方法 定期测定不同周龄段(4～6周龄，6～8周龄，9～12周龄，13～14周龄)141只绿色荧光蛋白转基因(GFP)小鼠和100只对照组C57BL/6J小鼠的体重和摄食量，对上述两种动物定期取血，测定血生化及血液学指标，对动物进行大体解剖，计算主要脏器(心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺，性腺)的脏器系数并进行组织病理学检测。结果 ①体重和摄食量：4周龄的GFP小鼠，其体重明显低于对照组，差异具有显著性(P＜0.01);4～5周龄的GFP小鼠，其摄食量明显高于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)。②血常规测定：6～8周龄，9～12周龄的GFP小鼠，其红细胞计数(RBC)明显低于对照组，差异具有显著性(P＜0.01);9～12周龄，13～14周龄的GFP小鼠，其白细胞计数(WBC)明显高于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)。③血生化测定：6～8周龄，9～12周龄，13～14周龄的 GFP小鼠，其尿酸(UA)值明显高于对照组，差异具有显著性(P＜0.01);6～8周龄，9～12周龄的GFP小鼠，其总蛋白(TP)，白蛋白(ALB)明显低于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)。④脏器系数：6～8周龄，9～12周龄的 GFP小鼠，其胸腺的脏器系数明显低于对照组，差异具有显著性(P＜0.01);9～12周龄，13～14周龄的GFP小鼠，其肝脏的脏器系数明显高于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)。⑤病理检测：6～8周龄有部分GFP小鼠胸腺发育不良，其他受检脏器和其他年龄段动物未见明显病理改变。结论①绿色荧光蛋白转基因小鼠与对照组C57BL/6J小鼠相比，在体重(4周龄)、摄食量(4～5周龄)、血常规(红细胞计数RBC、白细胞计数WBC、血红蛋白HGB)、血生化(尿酸UA、总蛋白TP、白蛋白ALB)、脏器系数(胸腺，肝脏)等指标上存在明显差异，但是其值均在正常范围内。②绿色荧光蛋白转基因小鼠在6～8周龄有部分小鼠胸腺发育不良。

绿色荧光蛋白转基因小鼠;血液常规;血液生物化学;病理学

绿色荧光蛋白具有荧光稳定，检测方便，对活细胞无伤害等优点，已被作为一种标记基因应用到生物学研究的各个领域［1］。本研究所使用的动物是将表达绿色荧光蛋白的基因导入小鼠体内，构建成能表达绿色荧光蛋白(GFP)的转基因小鼠。此种转基因小鼠可以利用光学成像技术跟踪靶细胞，是研究干细胞，肿瘤细胞的工具小鼠。目前国内外虽然有关于绿色荧光小鼠生理生化等各个检测指标的研究［2-3］，但是还不足以建立一个针对绿色荧光蛋白转基因小鼠的生理指标平台。本实验旨在针对各不同周龄的绿色荧光蛋白转基因小鼠，全面测定其生理，生化，组织病理学各指标，为新药安全评价工作的深入展开提供科学的基础数据。

1 材料与方法

1.1 转基因动物(由本所遗传中心构建)

PCR法从 pEGFP-N1质粒中扩增 EGFP基因，DNA序列分析证实没有突变。把EGFP基因克隆入系统性表达的chicken β-actin强启动子下游构建EGFP转基因载体。转基因载体用SalI线性化调整浓度至5 ng/μL，用显微注射法将线性化的转基因载体注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中。构建出表达绿色荧光蛋白的转基因小鼠。

1.2 动物来源和饲养环境

各不同周龄的转基因绿色荧光蛋白小鼠共141只【SCXK(京)2009-0004)】，对照组 C57BL/6J小鼠100只【SCXK(京)2009-0007】。动物购自：北京华阜康生物科技股份有限公司。动物饲养于中国医学科学院实验动物研究所屏障环境动物实验室内，日常喂以60Co照射的维持饲料。

1.3 仪器与试剂

日本日立7020全自动生化测定仪，德国Beckman全自动血球计数仪，日本樱花推拉式切片机(IVS-410)，德国徕卡石蜡包埋机(EG1150H+C)，德国徕卡全自动组织脱水机(ASP300)。

1.4 方法

1.4.1 体重和摄食量：每日观察动物，每周1次测定GFP转基因小鼠和其对照动物C57BL/6J小鼠的体重和摄食量。

1.4.2 血细胞计数指标：各周龄小鼠分批眼眶采血0.2 mL，EDTA-K3抗凝，全自动血细胞计数仪测定。测定指标包括红细胞计数(RBC)、血红蛋白(HGB)、白细胞计数 (WBC)及其分类，血小板计数(PLT)等9项。

1.4.3 血生化指标：各周龄小鼠分批眼眶取血0.3 mL，取血清在全自动生化分析仪上测定。测定指标包括丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、碱性磷酸酶(ALP)、尿酸(UA)、尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)、血糖(GLU)、总胆固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、球蛋白(GLO)，白蛋白/球蛋白(A/G)。

1.4.4 大体解剖：取动物脑、心脏、肝、脾、肺、胸腺、肾、性腺(雄性动物睾丸和附睾;雌性动物子宫和卵巢)，脏器称重并计算脏器系数。并将上述脏器用4%甲醛固定，进行病理学检测。

1.4.5 数据处理：采用 Excel统计软件，对所得数据进行均数与标准差计算并进行组间t检验。计量数据用均数±标准差表示。

2 结果

2.1 不同周龄GFP转基因小鼠和对照组C57BL/6J小鼠体重

GFP转基因小鼠与C57BL/6J小鼠的体重随周龄的增加呈上升趋势。4周龄的GFP转基因小鼠体重明显低于同周龄的 C57BL/6J小鼠，差异具有显著性(P＜0.01)。但在5～11周龄，GFP转基因小鼠与同周龄的C57BL/6J小鼠相比没有统计学差异(表 1)。

2.2 不同周龄GFP转基因小鼠和对照组C57BL/6J小鼠摄食量

4～5周龄的GFP转基因小鼠摄食量明显高于同周龄的C57BL/6J小鼠，差异具有显著性(P＜0.01)。6～11周龄的GFP转基因小鼠其摄食量与同周龄的C57BL/6J小鼠相比没有统计学差异(表2)。

表1 各周龄的GFP转基因小鼠与C57 BL/6J小鼠的体重统计(s，g)Tab.1The body weight of different week-old of GFP mice and C57 BL/6J mices，g)

表1 各周龄的GFP转基因小鼠与C57 BL/6J小鼠的体重统计(s，g)Tab.1The body weight of different week-old of GFP mice and C57 BL/6J mices，g)

注：与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01Note： There are 37 mice in the experimental group and 100 mice in the control group.Compared with the control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01

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表2 各周龄的GFP转基因小鼠与C57 BL/6J小鼠的摄食重统计(s，g)Tab.2The food intake of different week-old GFP mice and C57 BL/6J mice(s，g)

表2 各周龄的GFP转基因小鼠与C57 BL/6J小鼠的摄食重统计(s，g)Tab.2The food intake of different week-old GFP mice and C57 BL/6J mice(s，g)

注：与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01Note： There are 37 mice in the experimental group and 100 mice in the control group.Compared with the control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01

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2.3 不同周龄段GFP转基因小鼠与C57 BL/6J小鼠的血常规各项指标

6～8周龄和9～12周龄的GFP小鼠，其红细胞计数(RBC)明显低于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)。9～12周龄，13～14周龄的 GFP小鼠，其白细胞计数(WBC)明显高于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)。6～8周龄的 GFP小鼠，其血红蛋白(HGB)明显低于对照组，差异具有显著性 (P＜0.01)。6～8周龄的 GFP小鼠，其血小板(PLT)计数高于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)(表3)。

表3 不同周龄的GFP转基因小鼠与C57 BL/6J小鼠的血常规指标Tab.3 Blood routine examination of the 6-8，9-12，and 13-14-week-old GFP mice and C57 BL/6J mice

2.4 不同周龄GFP转基因小鼠与C57 BL/6J小鼠的血生化各项指标

6～8周龄，9～12周龄，13～14周龄的 GFP小鼠，其尿酸(UA)值明显高于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)。6～8周龄和9～12周龄的 GFP小鼠，其总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)明显低于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)。9～12周龄和13～14周龄的 GFP小鼠，其 A/G值明显低于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)。6～8周龄的 GFP小鼠其甘油三酯(TG)明显低于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)，其球蛋白(GLO)，尿素氮(BUN)低于对照组，差异具有显著性(P＜0.05)。9～12周龄的GFP小鼠其丙氨酸转氨酶(ALT)值明显高于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)，其乳酸脱氢酶(LDH)血糖(GLU)尿素氮(BUN)高于对照组，差异具有显著性(P＜0.05)。13～14周龄的尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)值明显高于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)，其白蛋白(ALB)低于对照组，差异具有显著性(P＜0.05)。其他检测指标GFP小鼠与对照组比较没有统计学差异(表4)。

表4 不同周龄的GFP转基因小鼠与C57 BL/6J小鼠的血生化指标(s)Tab.4 The values of blood biochemistry of 6～8，9～12，13～14-week-old GFP mice and C57 BL/6J mice

表4 不同周龄的GFP转基因小鼠与C57 BL/6J小鼠的血生化指标(s)Tab.4 The values of blood biochemistry of 6～8，9～12，13～14-week-old GFP mice and C57 BL/6J mice

注：各组与其相应的对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01Note： Compared with the control group，*P ＜0.05，**P ＜0.01

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2.5 不同周龄GFP转基因小鼠与C57 BL/6J小鼠的脏器系数

6～8周龄和9～12周龄的GFP小鼠，其胸腺的脏器系数明显低于对照组，差异具有显著性，(P＜0.01);9～12周龄和13～14周龄的GFP小鼠，其肝脏的脏器系数明显高于对照组，差异具有显著性(P＜0.01)(表5)。

2.6 病理检测结果

将上述各不同周龄的绿色荧光蛋白转基因GFP小鼠和C57 BL/6J小鼠的各受检脏器进行组形态学观察。6～8周龄有部分绿色荧光蛋白转基因小鼠胸腺发育不良，9周龄以上的绿色荧光蛋白转基因小鼠各受检脏器未见明显病理改变。各周龄的C57 BL/6J小鼠各受检脏器未见明显病理改变(见图1，彩插2)。

3 讨论

小鼠广泛用于药物筛选、生物制品检定、药品的毒性试验及三致(致畸，致癌，致突变)试验［4］。荧光成像具有操作简单、所得结果直观、灵敏度高等特点，在活体动物体内成像中可得到广泛应用［5-8］。而对于宏观的实验动物学来讲，其最大的优点在于可以不必剖杀即可活体进行检测，这大大减少了实验动物的数量，能极大地缩短毒性评价时间。因此可将此绿色荧光蛋白转基因小鼠应用于毒理学各个方面，如致癌试验、致畸试验等。

表5 不同周龄的绿色荧光蛋白GFP转基因小鼠与C57 BL/6J小鼠的脏器系数(单位：%)Tab.5 Organ coefficient of the 6-8，9-12，13-14-week-old GFP mice and C57 BL/6J mice(unit： %)

本实验选择C57BL/6J小鼠作为对照组。虽然绿色荧光蛋白转基因小鼠是在C57BL/6J小鼠的基础上构建成功的，但在生理、生化等指标上确实存在差异，但是其值均在在正常范围内。这与田小芸［2］等所得出的结论部分一致。

脏器系数统计显示，部分GFP小鼠的肝脏器系数与其对照组相比，有显著性差异。但是经病理检测发现，肝脏并无异常，因此认为此差异并非病变，而是生理性差异所致。部分小鼠的胸腺脏器系数与对照组相比，有显著性差异，经病理检测发现，此部分小鼠确有胸腺发育不良状况。

病理检测提示转基因绿色荧光蛋白小鼠部分胸腺发育缺陷。推测可能是绿色荧光蛋白转基因植入C57BL/6J小鼠体内，引起动物的发育迟缓所致。所以不排除外源GFP基因对小鼠发育存在一定毒性的可能。

在动物生长发育早期，绿色荧光蛋白转基因小鼠与对照组动物C57BL/6J小鼠比较，体重和摄食量明显降低，可能的原因是小鼠本身体质差异所致。本实验所用小鼠数量多，周龄范围广，对绿色荧光蛋白转基因小鼠进行了摄食、体重、血常规、血生化、病理等方面的检测，积累了各个周龄小鼠的丰富的生理生化数据，为转基因绿色荧光蛋白小鼠的深入研究建立了系统化的资料库。

(本文图1见彩插2。)

［1］ 张峰，任燕，陆长德.绿色荧光蛋白及其应用［J］.生命科学，1999，11(2)：61-65.

［2］ 田小芸，胡娟峰，恽时锋，等.EGFP转基因小鼠血液生理生化指标的测定［J］.中国比较医学杂志，2008，18(10)：56-58.

［3］ 王冬平，李善如，张敏，等.三种小鼠血液生理生化正常值的测定［J］.实验动物科学与管理，2000，17(2)：24-28.

［4］ 孙靖.实验动物学基础［M］.北京：北京科学技术出版社，2005.48-52.

［5］ Yang M，Baranov E，Moossa AR，et al.Visualizing gene expression by whole-body fluorescence imaging［J ］.Proc Natl Acad Sci U S A，2000，97：12278-122821.

［6］ Takada T，Iida K，Awaji T，et al.Selective production of transgenic mice using green fluorescent protein as a marker［J］.Nat Biotechnol，1997，15：458-4611.

［7］ Yang M，Reynoso J，Jiang P，et al.Transgenic nude mouse with ubiquitous green fluorescent protein expression as a host for human tumors［J ］.Cancer Res，2004，64：8651-86561.

［8］ Sangmi C，Therese A，Kai CS，et al.Analysis of different promoter systems for efficient transgene expression in mouse embryonic stem cell lines［J ］.Stem Cell，2002，20：139-1451

Physiological and biochemical indexes of the green fluorescent protein-transgenic mice

HE Xiao-yu，HE Jun，XU Yan-feng，QIN-Chao，GAO-Hong*
(Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Science，Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health，Beijing 100021，China)

Objective To establish a database of the physiological，biochemical and pathological indexes of the green fluorescent protein(GFP)transgenic mice and provide theoretical evidence for toxicological and other studies.Methods Two hundred and forty one GFP mice and 100 C57BL/6J mice were included in this study.These mice were of 4-6-week-old，6-8-week-old，9-12-week-old，and 13-14-week-old.The body weight and food intake of the mice were recorded regularly.The blood routine examination was performed and blood biochemical parameters were determined.The weight of organs(heart，liver，brain，lung，spleen，kidney，thymus，sex glands)were measured and their organ coefficients werecalculated.The organs were examined by histology as well.Results 1.Body weight： For the 4-week-old GFP mice，the body weight was lower than that of the control group，with a significant difference(P＜0.01).For the 4-5-week-old GFP mice，their food intake was higher than that of the control group，with a significant difference(P＜0.01).2.Blood routine examination： For the 6-8 and 9-12-week-old mice，the index RBC in the GFP mice were lower than that of the C57BL/6J mice with a significant difference(P ＜0.01).For the 9-12 and 13-14-week-old mice，the WBC in the GFP mice was higher than that in the C57BL/6J mice，with a significant difference(P ＜0.01).3.Blood biochemistry： For the 6-8，9-12，and 13-14-week-old mice，the index UA of the GFP mice was higher than that of the C57BL/6J mice，with a significant difference(P＜0.01).For the 6-8，9-12-week-old mice，the indexes TP and ALB of the GFP mice was lower than that of the C57BL/6J mice，with a significant difference(P ＜ 0.01).4.Organ coefficient： For the 6-8，9-12-week-old mice，the thymus organ coefficient of GFP mice was lower than that of the C57BL/6J mice，with a significant difference(P＜0.01).For the 9-12，13-14-week-old mice，the liver organ coefficient of GFP mice was higher than that of the C57BL/6J mice，with a significant difference(P ＜0.01).5.Pathology： There was thymus dysplasia in some of the 6-8-week-old GFP mice.While the rest of GFP mice and the mice of the control group were normal.Conclusions There were some physiological differences between the GFP mice and C57BL/6J mice such as body weight(4-week-old mice)，food-intake(4-5-week-old mice)，blood routine examination(WBC，RBC，HGB)，blood-biochemistry(UA，TP，ALB)，and organ coefficient(thymus，liver).There were no pathological changes in the GFP mice，except of thymus dysplasia in some of 6-8-week-old mice.

Green fluorescent protein transgenic mice;Blood routine examination;Blood biochemistry;Pathology

Q95-33，R349.83

A

1005-4847(2011)02-0145-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2011.02.013

重大新药创制科技重大专项课题(2008ZX09305-001)。

贺晓玉(1985-)，女，硕士研究生，E-mail：hxywxl2007@126.com

高虹(1968-)，女，E-mail：gaohongdws@yahoo.com.cn

2010-09-27