三七中人参皂苷Rh1的分离与纯化

李 龙 华， 富 瑶 瑶， 石 岭， 许 郁 峰， 鱼 红 闪， 金 凤 燮

( 1.大连工业大学 生物工程学院， 辽宁 大连 116034;2.大连生生绿谷生物工程有限公司， 辽宁 大连 116023 )

0 引 言

三七 [Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. Chen] 为五加科人参属植物，含有多种化学成分，其中三七总皂苷为主要有效活性成分之一，其质量分数为8%～12%[1]。三七中含有的人参皂苷Rh1为20(S)-原人参三醇(Protopanaxatriol)型皂苷[2-3]，具有极高的生理活性，在抑制癌细胞增值，抗肿瘤等方面体现了良好的药效[4]，因而获得人参皂苷Rh1单体对深入研究其药理作用具有重要意义。另外，三七比人参价格低，从三七中提取获得稀有人参皂苷Rh1，对人参皂苷Rh1的研究具有重要经济意义。

刘廷强等[5]研究了三七提取中人参皂苷的转化。目前文献对于人参皂苷Rh1的制备报道较少。本研究以药材三七为原料提取三七总皂苷，运用硅胶层析法从三七总皂苷中分离纯化人参皂苷Rh1，再经高效液相色谱检测产品纯度，为大量制备人参皂苷Rh1提供依据。

1 材料与方法

1.1 材 料

人参皂苷Rh1标准品，大连工业大学天然活性物质生物转化研究中心提供；三七，购于药店；薄层层析板Silica Gel 60-F254，德国 Merck 公司产品；大孔吸附树脂，南开大学化工厂；硅胶，青岛海洋化工厂。

1.2 实验方法

1.2.1 三七总皂苷的制备

取1 000 g的药材三七粉碎，加入7 000 mL 75%乙醇浸泡48 h，浸泡过程中适当搅拌，纱布、滤纸过滤后，收集浸出液，滤渣继续加入乙醇浸泡。同上法循环3次，将3次所得滤液合并，浓缩、干燥。将干燥粉末溶于1 000 mL的去离子水中，分别用400、300、300 mL石油醚分3次脱去其中的脂溶性成分，收集水相；然后用800、600、400 mL水饱和正丁醇分3次萃取三七总皂苷，收集正丁醇相，浓缩干燥。将干燥粉末溶于适量的去离子水中，经AB-8大孔吸附树脂柱反复吸附，8倍柱体积去离子水脱糖，6倍柱体积70%乙醇洗脱皂苷。收集皂苷洗脱液，采用D296大孔吸附树脂柱脱色，适量70%乙醇洗脱皂苷，直至TLC检测不再有皂苷流出，收集洗脱液，浓缩干燥，得三七总皂苷。

1.2.2 硅胶层析分离人参皂苷Rh1

样品胶的制备：称取三七总皂苷25 g充分溶解于氯仿-甲醇[V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶1]的混合溶液中，取80～100目的硅胶65 g，缓慢倾倒于皂苷溶液中，于70～80 ℃水浴边加热边搅拌，使硅胶与皂苷溶液均匀混合，待溶剂挥发完全后即成样品胶。

装柱：将400 g 300～400目硅胶作为分离胶均匀装入柱中，真空泵抽气，使之均匀细密。在硅胶上层均匀平铺4 cm起缓冲作用的80～100目硅胶，最后在顶层加入样品胶，并在其表面铺上棉花层。装柱后，首先用纯氯仿通柱，然后用氯仿-甲醇[V(氯仿)∶V(甲醇)=8.5∶1.5]混合液作为流动相洗脱，流出液每200 mL收集一次，TLC跟踪检测洗脱过程人参皂苷Rh1的流出情况。

1.2.3 薄层层析(TLC)

采用薄层层析法[5]检测人参皂苷Rh1。微量点样器吸取人参皂苷标准品及样品，点样于薄层层析板上。依照样品浓度确定点样量，每次点样均需风干再进行下一次点样。展开剂为氯仿-甲醇[V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶2.5∶0.5]混合液。显色剂10% H2SO4水溶液，加热显色。

1.2.4 高效液相色谱检测人参皂苷Rh1纯度

色谱仪，美国Waters 2695 Separations Module；检测器，美国Waters 2996 Photodiode Array Detector；色谱柱，C-18 Hypersil ODS2 5 μm (4.6 mm×150 mm)；工作温度，20 ℃；柱温，35 ℃；体积流量，1.0 mL/min；样品进样量，10 μL；检测波长，203 nm。

2 结果与讨论

2.1 三七总皂苷的提取

按照 “1.2.1”的制备方法，1 000 g药材三七制得三七根总皂苷粗品225.2 g；经提纯浓缩后得到三七总皂苷112.2 g；112.2 g三七总皂苷经大孔吸附树脂柱处理，得产品76.2 g，提取率为7.62%。三七总皂苷经TLC检测结果如图1所示。由图1可以看出，三七总皂苷中含有一定量的人参皂苷Rh1。

Rb1、Rd、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2和C-K，人参皂苷标准品；1，三七根总皂苷

图1 三七总皂苷的提取

Fig.1 Extract of total notoginsenoside fromPanaxnotoginseng

2.2 硅胶柱分离人参皂苷Rh1

按照“1.2.2”的方法分离人参皂苷Rh1，收集洗脱液，TLC检测结果如图2所示。由图2可知，对照标准品人参皂苷Rh1，三七总皂苷中的人参皂苷Rh1从第6组分开始出现，直至第15组分基本洗脱完全，其中第7、8、9组分为相对较纯净的人参皂苷Rh1。收集第7、8、9 3个组分的洗脱液，减压浓缩，蒸干后得人参皂苷Rh1单体0.36 g，得率为1.44%。

2.3 人参皂苷Rh1纯度的鉴定

取1 mL人参皂苷Rh1样品，溶于1 mL色谱甲醇中测定，HPLC结果如图3所示。由图3可知，三七总皂苷中分离得到的人参皂苷Rh1保留时间为36.646 min，纯度为66.08%，基本达到分离目的。

Rb1、Rd、Rg1和Rh1，人参皂苷标准品；原，三七根总皂苷；1～20，洗脱组分

图3 人参皂苷Rh1的纯度鉴定

3 结 论

采用乙醇浸提，石油醚脱脂，水饱和正丁醇萃取，大孔吸附树脂脱糖脱色对三七总皂苷进行制备。1 000 g药材三七粉碎后，经乙醇浸提获得三七总皂苷粗品225.2 g。经石油醚脱脂、水饱和正丁醇萃取后，得三七总皂苷112.2 g。经AB-8树脂柱脱糖，D296树脂脱色后，得三七总皂苷76.2 g，提取率为7.62%。

采用硅胶层析法精制三七总皂苷中的人参皂苷Rh1。25 g三七根总皂苷以氯仿-甲醇[V(氯仿)∶V(甲醇)=8.5∶1.5]混合液作为流动相洗脱，经硅胶层析得人参皂苷Rh1单体0.36 g，得率为1.44%，高效液相色谱检测其纯度为66.08%，基本达到分离目的。

[1] 张喜平,齐丽丽,刘达人. 三七及其有效成分的药理作用研究现状[J]. 医学研究杂志, 2007, 36(4):96-98.

[2] 张均田. 人参冠百草-人参化学、生物学活性和药代动力学研究进展[M]. 北京:化学工业出版社, 2008:34.

[3] YU Hong-shan, ZHANG Chun-zhi, LU Ming-chun, et al. Purification and characterization of new special ginsenosidase hydrolyzing multi-glycisides of protopanaxadiol ginsenosides, ginsenosidase type I[J]. Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2007, 55(2):231-235.

[4] 金凤燮. 天然产物生物转化[M]. 北京:化学工业出版社, 2009:78-79.

[5] 刘廷强,何璐璐,鱼红闪,等. 三七提取中人参皂苷的转化[J]. 大连工业大学学报, 2009, 28(3):111-114.

(LIU Ting-qiang, HE Lu-lu, YU Hong-shan, et al. Transformation of ginsenosides of Panax notoginseng during extraction[J]. Journal of Dalian Polytechnic University, 2009, 28(3):111-114.)