G8r菌产人参皂苷糖苷酶的酶性质及酶水解作用

陈 娇 娇， 孙 键， 金 凤 燮， 鱼 红 闪

( 大连工业大学 生物工程学院， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

人参(Panax ginseng C.A.Meyer)为五加科人参属多年生草本植物。按其品质情况及产地和生长环境不同，把人参分为野山人参、园参和高丽参3个品种[1]。现代药理研究发现，人参有抗心律失常，抗衰老的作用，近年来的研究还发现人参的有效成分还具有抗肿瘤作用[2]。人参皂苷是人参中主要有效成分, 具有人参的主要生理活性，具有极高的药用价值和应用前景。

人参皂苷C-K在天然的人参中并不存在，是其他二醇型人参皂苷在肠道内的降解产物和最终吸收形式，人参的许多生物学活性是由该化合物引起的,特别是抗衰老、改善记忆、抗肿瘤等方面都体现了良好的药效[3]。人参皂苷Rb1在人参中的含量较高，大约1%～3%，它和稀有皂苷C-K具有相同的母环结构。因此，可通过酶法将人参皂苷Rb1C-3位的两个—Glc键和C-20位的一个—Glc键水解，得到稀有皂苷C-K。目前，国内在这方面的研究较少。本研究采用实验室前期工作中筛选得到的Absidiasp.G8r菌株，该菌种通过液态发酵可得到一种人参皂苷糖苷酶，该酶能够水解人参皂苷Rb1生成稀有皂苷C-K，作者首先对这种人参皂苷糖苷酶进行了分离纯化，然后对该酶的性质和水解作用进行了研究。

1 材料与方法

1.1 材 料

菌种Absidiasp.G8r，由大连工业大学生物与食品工程学院菌种保藏室提供；薄层层析板Silica；人参皂苷Rb1、Rd、F2、Compound K(C-K)等标准品,实验室自制。

1.1.1 培养基的制备

液体发酵培养基的制备：

(1)称取100 g人参粉和300 mL水倒入烧杯中，文火加热，熬煮7 h，加热中注意补水。

(2)待冷却后，纱布过滤，滤液于7 000 r/min下离心10 min，取上清液，补水至200 mL制成人参浸出液。

(3)取人参浸出液12 mL加入10°的麦芽汁48 mL，再加40 mL水补齐到100 mL，制成人参皂苷糖苷酶液体发酵培养基，121 ℃湿热灭菌，待用[4]。

1.2 方 法

1.2.1 微生物的液体发酵及粗酶液的制备

取制备好的培养基100 mL，接菌2～3环，并置于28 ℃恒温培养箱中，培养4～5 d。

将培养好的发酵液，在8 000 r/min下离心15 min，取上清液在磁力搅拌条件下加入适量硫酸铵粉末调饱和度至75%，放入冰箱4 ℃下静置12 h后，在13 000 r/min下离心20 min。弃上清液，将沉淀用20 mmol/L pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液溶解后，倒入透析袋中，在缓冲液中透析24 h。透析结束后，在13 000 r/min下冷冻离心10 min，上清液即为粗酶液，放人冰箱内，保存备用[4]。

1.2.2 人参皂苷糖苷酶的分离纯化及分子质量的测定

取8 mL粗酶液，采用DEAE-Cellulose DE52阴离子交换柱(2.0 cm×10.5 cm)进行分离纯化[5]，最后得到纯化后的人参皂苷糖苷酶。

将得到的样品处理后，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法[6]，进行酶的纯度与分子质量检测。

1.2.3 酶活力的测定

用0.02 mol/L pH 5.0醋酸-醋酸钠缓冲液分别溶解人参皂苷 Rb1、Rd、F2，制成质量浓度均为5 g/L 的标准品溶液为酶作用的底物。

在酶性质研究中，以人参皂苷Rb1为底物生成人参皂苷C-K的酶活力测定：取0.1 mL 人参皂苷Rb1标准品溶液，加入酶液0.1 mL，在30 ℃温度下，反应22 h后，加入水饱和正丁醇0.2 mL，终止酶反应，经振荡、分层后，取上清液10 μL作薄层层析检测，展开，显色后立即扫描并复印。应用Band-scan工具软件，对TLC图谱进行产物含量分析[7]。

酶活力的定义：在30 ℃下反应22 h后，每小时生成1 nmol人参皂苷C-K所需的酶量即一个酶活力单位。

相对酶活力：底物转化成产物的转化率。

在酶反应过程研究中，以人参皂苷Rb1为底物生成Rd的酶活力测定：取0.1 mL人参皂苷Rb1标准品溶液，加入0.1 mL酶液，于30 ℃下反应8 h，然后用0.2 mL水饱和正丁醇终止反应，进行产物含量分析。酶活力的定义：在30 ℃下反应8 h条件下，每小时生成1 nmol人参皂苷Rd所需的酶量即一个酶活力单位。

以人参皂苷Rd为底物生成F2的酶活力的测定：取0.1 mL人参皂苷Rd标准品溶液，加入0.1 mL酶液，于30 ℃下反应10 h，然后用0.2 mL水饱和正丁醇终止反应，进行产物含量分析。酶活力的定义：在30 ℃反应10 h条件下，每小时生成1 nmol人参皂苷F2所需的酶量即一个酶活力单位。

以人参皂苷F2为底物生成C-K的酶活力的测定：取0.1 mL 人参皂苷F2标准品溶液，加入0.1 mL酶液，于30 ℃下反应8 h，然后用0.2 mL水饱和正丁醇终止反应，进行产物含量分析。酶活力的定义：在30 ℃反应8 h条件下，每小时生成1 nmol人参皂苷C-K所需的酶量即一个酶活力单位。

1.2.4 薄层层析(TLC)

人参皂苷糖苷酶的酶反应结果采用TLC法进行检测,展开剂为V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=7∶3∶0.5;显色条件：喷10%的H2SO4水溶液，然后在105 ℃下加热10 min显色。

1.2.5 酶性质的研究

研究纯化后得到的人参皂苷糖苷酶的酶反应条件。测定酶反应的pH值、酶反应的温度、金属离子对酶反应的影响。

1.2.6 酶水解作用的研究

分别取人参皂苷糖苷酶与底物人参皂苷Rb1各100 μL,于30 ℃下反应2、4、6、8、10、12、14、16、18、22、24、36、48、60、72 h。结果用TLC进行检测。

如图3所示，时间同步电路从北斗/GPS接收机接收两路信号，分别是串口(或网络)数据信号以及秒脉冲信号。鉴于雷达系统内部电磁环境复杂，存在高电压、大电流设备，会对授时数据信号和秒脉冲信号的传输产生干扰。工程设计上，分别从硬件和软件两方面采取措施，避免和滤除干扰，对授时数据和秒脉冲信号加以保护。

1.2.7 酶反应的动力学常数Km及最大反应速度Vmax

首先配制不同浓度的底物溶液。将酶液与不同浓度的底物溶液等比例混合后在pH 5.0、30 ℃条件下反应，反应结束后对酶活力进行测定，根据测定结果，采用Lineweaver-Burk作图，得到米氏方程、最大反应速率、米氏常数。

2 结果与讨论

2.1 人参皂苷糖苷酶的分离纯化及分子质量的测定

将发酵培养后得到的粗酶液采用DEAE-CelluloseDE52离子交换柱层析进行分离、提纯，用自动部分收集器对洗脱液进行收集，采用盐梯度细化、把纯化的酶液回收重新上柱等技术手段，对酶液进行反复的纯化，最终得到提纯的人参皂苷糖苷酶，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法蛋白检测，结果见图1。计算出人参皂苷糖苷酶的分子质量约为72 ku。

图1 人参皂苷糖苷酶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图

2.2 人参皂苷糖苷酶的酶性质的研究

2.2.1 pH对酶反应的影响

在30 ℃下，反应22 h，反应pH 分别为2.2、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0时测定剩余酶活力，得到酶的最适pH曲线。

将酶液分别在pH 2.2～10.0条件下，室温放置30 min后，酶反应在最适pH 5.0、30 ℃的条件下进行，对剩余酶活力进行检测后，得到酶的pH稳定性曲线。结果如图2所示。由图2可以看出，在pH 5.0时，人参皂苷糖苷酶的酶反应转化率达到最高，相对酶活力在pH 3.0～7.0达到50% 以上，而相对酶活力在pH 小于3.0或大于7.0时都有明显减退。因此，确定该酶的酶反应最适pH为5.0，在pH 3.0～7.0酶活力相对稳定。

图2 最适pH及pH稳定性曲线

2.2.2 温度对酶反应的影响

在20～80 ℃下将酶液分别热处理30 min，然后迅速冷却到室温，处理后的酶液在最适的测活体系(pH 5.0，30 ℃)中检测剩余酶活力，确定酶的温度稳定性,结果如图3所示。

图3 最适温度及温度稳定性曲线

由图3可见，随着温度的升高，酶活力逐渐增大，在30 ℃ 下的酶反应，酶活力达到最大值;温度继续升高，酶活力迅速下降，在80 ℃下的酶反应，酶活力几乎完全丧失。因此，确定人参皂苷糖苷酶的最适酶反应温度为30 ℃，在20～60 ℃ 下酶的稳定性较好。

2.3 人参皂苷糖苷酶的反应过程的研究

分别取人参皂苷糖苷酶与底物人参皂苷Rb1各100 μL，于30 ℃下反应2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、36、48、60、72 h，TLC结果如图4所示。由图4可知，酶反应开始，随着时间的进行，人参皂苷Rb1逐渐减少，生成Rd；大约10 h， Rd逐渐减少，生成F2；在18 h，F2逐渐减少，生成C-K。反应72 h后，几乎所有的人参皂苷Rb1都被水解。所以人参皂苷糖苷酶水解人参皂苷Rb1的过程为Rb1→Rd→F2→C-K。结构图如图5所示。由图5可知，整个酶反应的过程是单个酶的多步反应。人参皂苷Rb1、Rd、F2、C-K具有相同的母环结构，在C-3、C-20位连接不同的糖苷键，该人参皂苷糖苷酶先水解Rb1C-20位的(1-6)Glc键，生成Rd；再水解Rd C-3位的(1-2)Glc键，生成F2；再水解F2C-3位的Glc键，最后得到C-K。

图5 酶水解Rb1生成C-K的转化过程图

2.4 酶反应动力学常数Km及最大反应速率Vmax

以Rb1为底物，配成不同浓度S，取100 μL酶液与不同浓度的底物溶液，在30 ℃ 下反应8 h后，测定酶活力，酶活力的定义：在30 ℃反应8 h的条件下，每小时生成1 nmol人参皂苷Rd的酶量即一个酶活力单位。依据测定结果，采用Lineweaver-Burk作图，结果如图6所示。由图6可见，依据测定结果，得到米氏方程：1/V=6.436/S+0.656，最大反应速率Vmax=1.524 mmol/(L·h)，米氏常数Km=5.495 mmol/L。以Rd为底物，配成不同浓度S，分别取100 μL酶液与不同浓度的底物溶液，在30 ℃ 下反应10 h后，测定酶活力，酶活力的定义：在30 ℃反应10 h的条件下，每小时生成1 nmol人参皂苷F2的酶量即一个酶活力单位。依据测定结果，采用Lineweaver-Burk作图，结果如图7所示。

图6 人参皂苷糖苷酶的Lineweaver-Burk图

Fig.6 Lineweaver-Burk plot of ginsenoside-glyosidase

图7 人参皂苷糖苷酶的Lineweaver-Burk图

由图7可见，依据测定结果，得到米氏方程：1/V=6.07/S+1.106，最大反应速率Vmax=0.904 mmol/(L·h)，米氏常数Km=5.488 mmol/L。

以F2为底物，配成不同浓度S，取100 μL酶液与不同浓度的底物溶液，在30 ℃ 下反应8 h后，测定酶活力，酶活力的定义：在30 ℃反应8 h的条件下，每小时生成1 nmol人参皂苷C-K的酶量即一个酶活力单位。依据测定结果，采用Lineweaver-Burk作图，结果如图8所示。

图8 人参皂苷糖苷酶的Lineweaver-Burk图

由图8可见，依据测定结果，得到米氏方程：1/V=11.661/S+2.254，最大反应速率Vmax=0.447 mmol/(L·h)，米氏常数Km=5.176 mmol/L。

3 结 论

通过对Absidiasp.G8r菌株的液体发酵培养，得到了一种能够将人参皂苷Rb1水解，生成稀有人参皂苷C-K的人参皂苷糖苷酶。该酶的蛋白分子质量约为72 ku，酶反应的最适pH值为3.0，在pH 3.0～7.0酶活力较稳定；最适酶反应温度为30 ℃ ，在20～60 ℃下酶活力稳定性较好。该酶水解人参皂苷Rb1生成稀有皂苷C-K的过程是单个酶的多步反应，酶首先水解Rb1生成Rd；大约在8 h，酶水解Rd生成F2；在18 h，酶水解F2生成C-K。并对整个过程的酶反应动力学进行研究，最大反应速率分别为1.524、0.904、0.447 mmol/(L·h)，米氏常数分别为5.488、5.176、5.495 mmol/L。以上研究结果为今后研究酶法水解人参皂苷侧链糖基，制备高活性皂苷，提供了理论依据。

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