固定化酶法手性转化右旋磷霉素的初步研究

姜平，孙杨，孙东阳，张怡轩

(沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，辽宁沈阳110016)

固定化酶法手性转化右旋磷霉素的初步研究

姜平，孙杨，孙东阳，张怡轩*

(沈阳药科大学生命科学与生物制药学院，辽宁沈阳110016)

研究确定沙门柏干酪青霉菌(Penicillium camemberti)2221能够产生手性转化右旋磷霉素的酶，以及以海藻酸钠为载体固定化酶转化的最适条件。以海藻酸钠为载体，分别考察了海藻酸钠浓度、氯化钙浓度、海藻酸钠和酶用量的体积比、固定化时间等条件，以及固定化酶的最适反应pH、最适反应温度和反复利用的稳定性等。结果表明，最优固定化条件是3.0%(质量与体积比)海藻酸钠、3.0%(质量与体积比)氯化钙、酶液(浓缩20倍)和3.0%(质量与体积比)海藻酸钠溶液的体积比为1∶2、固定化时间为6 h。固定化酶的最适温度为37℃，最适pH为6.2，转化率为14.3%，连续反应4次后转化率为最初的57.57%。利用海藻酸钠包埋固定化沙门柏干酪青霉菌产生的手性转化右旋磷霉素的酶，能够连续转化生成左旋磷霉素，提高酶的利用效率，延长使用时间，具有进一步研究开发的价值。

左旋磷霉素;右旋磷霉素;生物转化;固定化;海藻酸钠

磷霉素((－)-(1R，2S)-1，2-环氧丙烯磷酸，(－)-(1R，2S)-1，2-epoxypropylphosphonic acid，fosfomycin，phosphonomycin，FOM)是1969年由Merck公司的Hendlin等［1］于Streptomyces fradiae (ATCC 21096)发酵液中发现，是一种小分子的广谱抗生素，对革兰阳性菌和革兰阴性菌均有杀灭作用，特别对绿脓杆菌、变形杆菌、链球菌、沙雷菌及对多种药物有耐药性的葡萄球菌和大肠埃希菌均能显示优异的抗菌活性。磷霉素分子量小、半衰期长，容易渗入各种组织。其不良反应少，主要为胃肠道和皮肤症状，多可耐受或为一过性反应。新生儿和儿童对磷霉素耐受性也较好［2］。由于磷霉素分子结构简单，目前工业生产仍使用早期发明的化学合成法，但该方法生产的总收率不足35%，且产物为外消旋体，其中有与左旋磷霉素等量的无活性的右旋磷霉素，无法加以利用［3］。因此，实现右旋磷霉素的转化，是降低磷霉素生产成本、提高产值、减少废物、废水排放的一条有效途径。目前发现具有转化产生磷霉素能力的微生物包括真菌、放线菌、细菌等，绝大多数是将磷霉素生产的原料顺丙烯磷酸转化为左旋磷霉素［4-6］，但产量很低，只有1.15 mg/mL［7-8］，且底物投料量有待提高，成本远远高于化学合成法，故未被广泛采用。另一方面，对于化学法产生的废弃物右旋磷霉素手性转化的报道很少，张雪姝等［9］以右旋磷霉素为底物，对东北制药总厂土样中菌株进行了筛选，最终得到3株细菌能将右旋磷霉素转化为左旋磷霉素，但由于菌株自身条件限制，底物投料量和转化率均有待提高。本实验室前期报道1株能够将右旋磷霉素手性转化成左旋磷霉素的沙门柏干酪青霉(Penicillium camemberti)2221［10］，在此基础上研究发现，不加底物的菌体发酵液上清中含有能够手性转化右旋磷霉素的物质，推测具有生物转化作用的酶为组成型酶类或酶系。本实验浓缩发酵上清液后获得粗酶，对此酶进行固定化条件的摸索研究。与游离酶相比较，利用固定化酶可以很方便地分离产物和重复使用酶类，有利于提高酶的利用效率，延长使用时间。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株右旋磷霉素手性转化菌:沙门柏干酪青霉2221(Penicillium camemberti)，本实验室保藏;生物检定菌:藤黄八叠球菌，本实验室保藏。

1.1.2 培养基PDA培养基:葡萄糖10 g，琼脂20.0 g，马铃薯浸汁(去皮马铃薯200.0 g，切成块状，加蒸馏水1 L煮沸30 min，4层纱布过滤得浸汁)定容至1 L，pH 7.2～7.5;PDB液体培养基:不加琼脂的PDA培养基。

1.1.3 主要试剂和仪器右旋磷霉素(东北制药总厂)，左旋磷霉素钠(哈药集团三精制药股份有限公司)，海藻酸钠(国药集团化学试剂有限公司)，其余试剂均为市售分析纯试剂;冷冻干燥离心机FD-1(北京博医康实验仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的制备菌株沙门柏干酪青霉在含有0.05%底物PDA斜面培养基活化后，将孢子接种于60 mL装有玻璃珠的PDB液体种子培养基中，接种量为108个/瓶，28℃，180 r/min培养24 h;按照10%的转种量转种到含有0.3%葡萄糖的装有玻璃珠的PDB液体发酵培养基中，28℃，180 r/min培养4 d，2层滤纸抽滤除去菌丝体，冷冻干燥上清液，用生理盐水溶解粗酶，浓缩倍数为20倍，制成粗酶液。

1.2.2 固定化酶的制备取粗酶液1 mL，将1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0% (质量与体积比)的海藻酸钠溶液，按照一定粗酶液和海藻酸钠的配比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)混合均匀，滴入1%、2%、3%、4%、5%、6%(质量与体积比)浓度CaCl2溶液制备海藻酸钠凝胶小球，4℃分别固定2、4、6、8 h，转入0.5%CaCl2溶液4℃过夜，用生理盐水洗净，获得固定化酶小球。

1.2.3 固定化酶条件的优化分别以CaCl2浓度(质量与体积比)、海藻酸钠溶液(质量与体积比)、酶液∶海藻酸钠体积比为唯一变动因素制备海藻酸钠凝胶小球，4℃固定6 h，得到固定化酶。反应后，测定相对转化率，找到最优化的固定条件。

1.2.4 固定化酶酶学性质的研究①温度对固定化酶活力的影响:在最优固定化条件下，分别考察22、28、33、37、42、50℃对固定化酶转化率的影响;②pH对固定化酶活力的影响:在最优固定化条件下，分别考察pH 3.0、4.5、5.6、6.2、7.0、7.4、8.0对固定化酶转化率的影响;③固定化酶反复利用的稳定性:在最优固定化条件下，反复使用同一批次固定化酶进行多次转化，测定每次转化率。

1.2.5 转化率的测定①磷霉素浓度与抑菌圈直径标准曲线的制备［11］:准确称取磷霉素钠标准品10 mg(相当于7.801 mg磷霉素，1 mg C3H5Na2O4P=0.7801mgC3H7O4P，1mg C3H7O4P=1000 u)加入1 mL无菌水，振荡使之完全溶解，即得10 mg/mL磷霉素钠溶液，用无菌水分别稀释成50、100、200、300、500、700、1000 μg/mL标准溶液。用微量进样器吸取不同浓度的磷霉素钠稀释液10 μL，将其加在带有2层直径6 mm滤纸片的藤黄八叠球菌平板上，37℃培养18 h后，测定抑菌圈直径，以磷霉素钠浓度(μg/mL)的对数值为横坐标，抑菌圈直径(mm)为纵坐标作图，制得标准曲线;②转化率的测定:按照1.2.2制备固定化酶，取等量于1 mL粗酶液的固定化酶加入到10 mL含有0.3%(质量与体积比)底物的磷酸缓冲液体系中(pH 6.2)，在28℃下120 r/min振摇培养12 h。取固定化酶转化液10 μL滴加到滤纸片上，进行生物检定，取0.3%底物做阴性对照，根据标准曲线计算反应液中磷霉素含量，以产生的最高磷霉素浓度为转化率100%，其他浓度与之相比较，计算得到相对转化率。

2 结果

2.1 磷霉素含量标准曲线

实验表明在50～100 μg/mL范围内磷霉素钠浓度的对数和抑菌圈直径呈线性关系，线性方程:y=15.272x－16.501(图1)。

图1 磷霉素钠浓度标准曲线Fig.1Standard concentration curve of levo-fosfomycin

2.2 固定化条件的优化

2.2.1 CaCl2浓度对固定化酶活力的影响实验结果表明，1%浓度CaCl2溶液制得的凝珠不成形;3%CaCl2获得的固定化酶的转化率最高;4%以上的CaCl2溶液制得的固定化酶转化率开始降低(图2)。分析认为，海藻酸钠包埋法主要是基于Ca2+置换海藻酸钠的Na+，从而形成空间网格状结构，将酶固定在网格其中，过低的CaCl2浓度形成的空间网格过于疏松，不利于酶的固定;过高的CaCl2浓度加大了空间网格状结构对酶的挤压，导致酶的空间结构发生改变，降低酶的活性，另一方面，过密的网格状结构也会使底物和酶的接触变得困难，从而降低酶活。因此，最优的CaCl2浓度为3%。

图2 CaCl2浓度对固定化酶活力的影响Fig.2Effect of CaCl2of different concentration on immobilized enzyme activity

2.2.2 海藻酸钠浓度对固定化酶活力的影响观察发现，1%和1.5%的海藻酸钠形成的小球不成形;3%的海藻酸钠形成的凝胶小球粒径均匀，机械强度好;而4%海藻酸钠过于粘稠(表1)。当海藻酸钠浓度超过3%时，形成的凝胶小球壁厚，底物与酶的接触困难，固定化酶转化率开始下降(图3)。因此，最优的海藻酸钠浓度为3%。

表1 海藻酸钠浓度对固定化效果的影响Table 1Effect of concentration of sodium alginate on the efficiency of immobilization

图3 海藻酸钠浓度对固定化酶活力的影响Fig.3Effect of sodium alginate of different concentration on immobilized enzyme activity

2.2.3 固定化时间对固定化酶活力的影响分别取2、4、6、8 h为固定化酶的固定时间，转化结果见图4。当固定化时间过短时，由于Ca2+置换海藻酸钠的Na+没有达到平衡，导致固定化小球网格过大，酶容易游离出来，达不到固定效果;而固定化时间过长即超过6 h时，形成的小球网格过于紧密，酶和底物的接触困难，酶活力下降。由图4可知，固定化时间为6 h，转化率最高，固定化酶活力最高。

图4 固定化时间对固定化酶活力的影响Fig.4Effect of immobilization time on immobilized enzyme activity

2.2.4 海藻酸钠溶液和粗酶液的体积比对固定化酶活力的影响分别选取3%浓度海藻酸钠溶液与粗酶液的体积比为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1制备固定化酶，结果见图5。海藻酸钠与酶液的体积比为2∶1时酶活力最大;随着比例增大，酶活力下降。分析认为，海藻酸钠和酶液的体积比变相改变了海藻酸钠的浓度，比例为1∶1时，海藻酸钠浓度变小，形成的凝胶小球形状不规则，机械程度低，酶活力低;比例增大为2∶1时，海藻酸钠浓度变相增高，形成的凝胶小球形状均匀，机械程度高，酶活力增高，转化率最高，说明此条件下固定化酶的活力最高;当比例增加到3∶1和4∶1时，形成的凝胶小球网格过小，影响酶的催化作用，酶活力下降，因此固定化最优条件为3%海藻酸钠溶液和酶液的体积比为2∶1。

图5 海藻酸钠溶液和粗酶液的体积比对固定化酶活力的影响Fig.5Effect of volume ratio of sodium alginate solution and crude enzyme solution on immobilized enzyme activity

综合以上结果，最终确定将3%海藻酸钠溶液和粗酶液的体积比为2∶1混匀后，滴入3% CaCl2溶液中，固定化6 h，得到的固定化酶活力最高。

2.3 固定化酶的酶学性质

2.3.1 固定化酶的最适温度由图6可知，最佳反应温度为37℃，高于和低于此温度会导致转化率下降，即固定化酶活力下降。

2.3.2 固定化酶的最适pH由图7可知，当pH 3～6时，固定化酶转化率变化不大，说明此固定化酶适宜在弱酸条件下催化反应;超过pH=6则转化率显著下降，说明固定化酶活力下降，故最佳的pH为6.2。

2.3.3 固定化酶反复利用的稳定性考察了同批次固定化酶多次转化右旋磷霉素的能力。由图8可知，随着反应次数的增加，转化率逐步降低，在酶反应4次后，转化率降低至最初的57.57%。

图6 温度对固定化酶活力的影响Fig.6Effect of temperature on immobilized enzyme activity

图7 pH对固定化酶活力的影响Fig.7Effect of pH on immobilized enzyme activity

图8 使用次数对固定化酶的影响Fig.8Effect of used times on immobilized enzyme activity

3 结论与讨论

本文采用海藻酸钠作为载体进行固定化，具有操作简便、材料易得、安全性能高等优点。通过单因素分析，最终确定将3%海藻酸钠溶液和20倍浓缩酶液按照体积比为2∶1混合后，滴入3% CaCl2溶液中，固定化6 h制备固定化酶酶活力最高。该固定化酶最适pH 6.2，最适温度37℃，最高转化率为14.3%，连续反应4次后，依然保存57.57%酶活性。

从前期实验中发现，手性转化右旋磷霉素的酶为一种胞外酶，但该酶是一种有多个活性中心的多功能酶，还是由一组酶组成的酶系，尚不清楚。根据文献研究，Itoh等［6］从土壤中筛选得到15株需氧型细菌和2株放线菌可以转化顺丙烯磷酸为左旋磷霉素，通过加入不同的底物和辅酶，发现上述活性菌细胞裂解液中含有某种活性物质，可以将顺丙烯磷酸转化为左旋磷霉素，证明为依赖于NAD(P)H的单加氧酶的环氧化作用。另Liu P等［12］发现菌株Streptomyces wedmorensis产生的2-羟基丙基磷酸环氧化酶，可以将2-羟基丙基磷酸环氧化为磷霉素，此过程需要Fe2+和NAD (P)H才能实现。因此推测，从沙门柏干酪青霉菌2221发酵上清中提取的粗酶，在将右旋磷霉素手性转化成左旋磷霉素的过程中，很可能是需要辅基参与的由多个酶催化的开环和环氧化反应。

实验结果显示，随着固定化小球利用次数的增多，酶的转化能力下降，即酶活力下降。这部分原因可能是由于该酶的辅基会从小球中逐渐游离出来，从而使酶活性丧失，转化率降低，这种推测还需要进一步深入的实验研究。但此酶是一种胞外酶，粗酶易于分离;且生产菌为真菌，0.3%底物浓度下对其无生长抑制作用，培养简便，生产成本低，并具有直接将右旋磷霉素转化为左旋磷霉素的作用，避免右旋磷霉素工业污染，变废为宝，具有工业应用的前景。

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Chiral Transformation of Dextral-Fosfomycin by Enzyme Immobilization Method

JIANG Ping，SUN Yang，SUN Dong-yang，ZHANG Yi-xuan
(Sch.of Life Sci.＆Bio-Pharm.，Shenyang Pharm.Uni.，Shenyang，110016)

Study confirmed that Penicillium camemberti(PC)2221 produced an extracellular enzyme that chirally transformed dextral-fosfomycin to levo-fosfomycin.The optimal conditions of immobilized enzyme(IE)using sodium alginate as carrier were studied.The optimum conditions for immobilization and characteristic of the IE were investigated，including concentrations of sodium alginate and CaCl2，the best conditions for reaction such as pH，temperature，and the stability of repeatedly uses.The results showed that the optimal conditions of the immobilization was 3%(w/ v)sodium alginate solution，3%(w/v)CaCl2solution，the volume ratio 1∶2 of sodium alginate solution(3%w/v) and crude enzyme solution(concentrated 20 times)，6 h immobilization time.The optimal pH and temperature of the IE were pH 6.2 and 37℃with the transformation rate at 14.3%.When reacted for four times continuously，the transformation rate was 57.57%of the initial one.The enzyme produced by PC 2221 could immobilize by sodium alginate at the optimal condition，and the IE could chirally transform dextral-fosfomycin to levo-fosfomycin to improve its utilization ratio and extent its life and possessed further study on the development value.

levo-fosfomycin; dextral-fosfomycin;biotransformation;immobilization;sodium alginate

Q949.327.1

A

1005－7021(2011)01－0051－06

辽宁省教育厅高等学校创新团队项目(2008T190)

姜平女，硕士。研究方向为微生物与生化药学。E-mail:muyi232377@163.com

*通讯作者。E-mail:zhangyxzsh@163.com

2010-12-14;

2011-01-21