紫外分光光度法测定破壁灵芝孢子粉提取物总三萜含量

陈冠州，梁慧敏，谢意珍

( 1.广东粤微食用菌技术有限公司，广东广州510663 ; 2.广东省微生物研究所广东省菌种保藏与应用重点实验室广东省微生物应用新技术公共实验室，广东广州510070 )

紫外分光光度法测定破壁灵芝孢子粉提取物总三萜含量

陈冠州1，梁慧敏1，谢意珍2*

( 1.广东粤微食用菌技术有限公司，广东广州510663 ; 2.广东省微生物研究所广东省菌种保藏与应用重点实验室广东省微生物应用新技术公共实验室，广东广州510070 )

确定一种破壁灵芝孢子粉提取物总三萜紫外分光光度测定方法。采用紫外分光光度法，以熊果酸为对照品测定样品。溶液在波长548 nm处具有最大吸光度，熊果酸含量在14～54 μg范围内呈良好的线性关系，r为0.9994，平均回收率为92.94%。提示使用上述方法绘制标准曲线可计算出样品中三萜类化合物的含量。测定方法操作简便、检验快速、稳定性高、重复性好，可以用于灵芝孢子粉产品的质量控制。

灵芝孢子粉;总三萜;熊果酸;紫外分光光度法

灵芝孢子是灵芝在生长成熟期从菌盖背面弹射出来的孢子，为灵芝的生殖细胞，其药用价值正日益受到重视，并已制成多种保健食品。灵芝孢子的化学成分包括以下几类:蛋白质和氨基酸类、糖肽类、维生素类、胡萝卜素、甾醇类、三萜类、生物碱类、脂肪酸类、内酯和无机离子类等［1］。三萜类化合物是灵芝的主要有效成分之一，具有广泛的生理活性，已成为除灵芝多糖外控制灵芝产品质量的重要参数。灵芝孢子粉中的三萜类化合物包括:灵芝孢子酸A(Ganosporeic acid A)、灵芝酸A、B、C、E、γ、δ、ε、ζ和θ(Ganoderic acid A、B、C、E、γ、δ、ε、ζ、θ)、GanoderiolF、Ganodermanontriol、Ganodermanondiol、Lucidumol A、Lucidumol B、Lucidenic acid SP1等。五环三萜内酯类有赤芝孢子内酯A和B(Ganosporelactone A，B)［1］。在实际生产的质量监控中，需要测定方法简便、快速、灵敏、重复性好。三萜类化合物在无水条件下，与强酸(硫酸、磷酸、高氯酸)作用会产生颜色变化或荧光。其中Libermann-Burchard反应，即醋酐-浓硫酸反应:将样品溶解于醋酐中，加浓硫酸-醋酐，能产生颜色变化，一般由黄色转为红色、紫色或绿色，而三萜皂苷只能转变为红、紫或蓝色，不出现绿色［2］。根据这一反应可对灵芝的三萜和皂苷进行比色法测定。本文采用香草醛-冰醋酸、高氯酸显色的比色方法，以熊果酸为对照品对破壁灵芝孢子粉提取物的总三萜成分进行测定;并比较水浴反应温度、显色剂的用量、测定波长等条件，选出最佳条件参数，还对测定方法的线性关系、稳定性、回收率等方面进行验证。确定一种应用于工业生产上的科学、稳定、快速检验灵芝孢子粉产品中的总三萜类含量的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品与试剂熊果酸标准品，Sigma-Aldrich公司，含量97%;高氯酸、冰醋酸、香草醛、三氯甲烷、乙酸乙酯均为分析纯;破壁灵芝孢子粉提取物，广东粤微食用菌技术有限公司。

1.1.2 主要仪器与设备WFZ UV-2100紫外可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司;DKS22型水浴锅，上海精宏实验设备有限公司; AS10200ADT型超声波清洗器，天津奥特赛恩斯仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 标准品溶液的制备精密称取熊果酸标准品15.0 mg，用乙酸乙酯定容于100 mL容量瓶中，即得0.146 mg/mL熊果酸标准品溶液。

1.2.2 样品溶液的制备准确称取破壁灵芝孢子粉提取物0.5 g，加入三氯甲烷50 mL，搅拌均匀后超声波(50℃、45 kHz)处理1 h，然后冷却后过滤，除去残渣，提取液定容至50 mL，即得样品溶液。

1.2.3 分析方法取0.3 mL提取液于60℃水浴蒸干。然后加入0.40 mL 5%香草醛-冰乙酸溶液和1.00 mL高氯酸，在60℃水浴加热15 min并移入冰水浴中，再加入5.00 mL冰乙酸，摇匀后置于室温。15 min后在一定波长下测定样品溶液的吸光度。

2 结果与分析

2.1 测定波长的选择

取熊果酸标准对照溶液0.3 mL 3份，水浴加热蒸干溶剂，分别加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.4 mL和高氯酸1.0 mL，于60℃水浴加热15 min后移入冰水浴中，再加入冰乙酸5.0 mL，摇匀后置于室温。据王江海等［3］报道可在548 nm处测定，所以选取15 min后用分光光度计于540、542、544、546、548、550、552 nm不同波长下测定样品溶液的吸光度，根据吸光度大小选择测定的波长。测定结果显示，在548 nm波长下吸光度值最大，因此选择548 nm为测定波长，见图1。

图1 不同波长的测定结果Fig.1The detection result of different wavelength

2.2 显示剂使用条件选择

2.2.1 5%香草醛-冰乙酸用量考察精密吸取熊果酸标准对照溶液0.3 mL 6份，水浴蒸干后分别加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，然后再分别加入高氯酸1.0 mL，置于60℃水浴中加热15 min后移入冰水浴中加入5 mL冰醋酸，摇匀后置于室温下，15 min后用分光光度计在548 nm测定其吸光度，见图2。

2.2.2 高氯酸用量考察精密吸取熊果酸标准对照溶液0.3 mL 6份，水浴蒸干后分别加入5%香草醛-冰乙酸溶液0.4 mL，再分别加入高氯酸0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mL，置于60℃水浴中加热15 min后移入冰水浴中加入5.0 mL冰醋酸，摇匀后置于室温下，15 min后用分光光度计在548 nm测定其吸光度，见图3。

图2 不同香草醛-冰乙酸用量的测定结果Fig.2Results of different dosage of vanillin-glacial acetic acid

图3 不同高氯酸用量Fig.3Different dosages of perchloric acid

2.2.3 水浴温度的考察精密吸取熊果酸标准对照溶液0.3 mL 5份，按上述的优选结果水浴15 min，其温度在40、50、60、70、80℃，同时做空白对照，观察在不同水浴温度时吸光度以及在这个水浴温度时空白颜色是否变化，见图4。结果表明:在其他条件恒定时，随着5%香草醛-冰乙酸用量的增加，吸光度值增大，到0.4 mL出现最大值，之后随着5%香草醛-冰乙酸用量的增加吸光度值开始下降。因此，0.4 mL为5%香草醛-冰乙酸溶液最佳用量。在其他条件恒定时，随着高氯酸用量的增加，吸光度相应增大，至1.0吸光度最大，因此选择1.0 mL为高氯酸最佳用量。在其他条件恒定时，随着温度的升高，吸光度相应增大，但水浴温度超过60℃时，空白液颜色开始变化，颜色有些淡褐色。因此，选择60℃为水浴温度。

图4 不同水浴温度Fig.4Different temperature of waterbath

2.3 标准曲线的绘制

精密吸取熊果酸标准对照溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，按上述优选条件及步骤在548 nm处测定吸光度，以吸光度为横坐标，熊果酸的毫克数为纵坐标，作图得到标准曲线与回归方程，考察熊果酸在相关浓度范围内线性关系，见图5。

图5 熊果酸溶液的标准曲线Fig.5Standard curve of Ursolic acid solution

以吸光度为横坐标，熊果酸的毫克数为纵坐标作标准曲线，得回归方程:y=0.0090x－0.0066，r=0.9994，表示吸光度与熊果酸含量在14.6～73 μg范围内呈良好的线性关系。

2.4 重复性考察

吸取样品液0.1 mL，按标准曲线方法一式3份进行测定。观察总三萜测定方法结果重现性，见表1。

表1 样品中总三萜含量分析结果Table 1The detection result of triterpenoids in broken Ganoderma lucidum spore extract

样品分析结果表明，2批样品中总三萜含量比较接近，约3.5%，RSD＜1.5%，结果重现性较好。

2.5 稳定性考察

吸取样品液0.1 mL，按标准曲线方法，分别在0～5、5～30、30～60、60～100 min几个时间段进行吸光度测定，观察其稳定性，见图6。

图6 吸光度的稳定性曲线Fig.6The stable curve of the absorbance

结果表明:吸光度在0～5 min内不稳定，RSD为2.54%，5～20 min之间较稳定，RSD为1.01%，20～60 min稳定性开始下降，RSD为5.08%，60～100 min稳定性则较差，RSD为 12.13%。因此，显色液适合在5～30 min内测定吸光度。

2.6 回收率测试

表2 回收率测试结果Table 2Results of recovery experiments

吸取样品液0.2 mL 3份，水浴蒸干后再分别加入熊果酸标准对照溶液0.2 mL，同样条件水浴蒸干，按分析方法测定其吸光度，对比标准曲线计算三萜回收率，见表2。平均回收率为92.94%，RSD为0.37%。

3 讨论

本实验验证破壁灵芝孢子粉提取物总三萜含量测定方法的科学性与稳定性，选用了熊果酸为对照品，5%香草醛-冰乙酸和高氯酸为显色剂，60℃水浴15 min，548 nm为测定波长。

目前国内仍未形成国家统一标准的检验方法来测定灵芝孢子粉产品中的三萜类化合物，也无灵芝酸标准品的供应。熊果酸标准品已广泛应用于医药行业，这种采用五环三萜类熊果酸为对照品，香草醛-冰醋酸、高氯酸显色的比色测定方法简便可靠，可以用于灵芝孢子粉产品的质量控制。

［1］林志彬，王鹏云.灵芝孢子及其活性成分的药理研究［J］.北京大学学报(医学版)，2006，5(38):541-547.

［2］姚新生.天然药物化学(第3版)［M］.北京:人民卫生出版社，2002:73-74.

［3］王江海，袁建平，徐世平，等.薄层色谱—光度法测定灵芝孢子油中的总三萜含量［J］.中国食品学报，2004，4(3):76-78.

Quantification of Triterpenoids Acids in Broken Ganoderma lucidum Spore Extract by Ultraviolet Spectrometry

CHEN Guan-zhou1，LIANG Hui-min1，XIE Yi-zhen2
(1.Yuewei Edible Fungi Technol.Co.Ltd.，Guangzhou 510663; 2.Guangdong Inst.of Microbiol.，Guangdong Prov.Key Lab.of Microbial Culture Coll.＆Appl.，Guangdong Open Lab.of Applied Microbiol.，Guangzhou 510070)

A UV spectrometry method to test triterpenoids in wall-broken Ganoderma lucidum(Gl)spore powder extract was established.The sample was assayed with ursolic acid by UV spectrometry.The concentration of ursolic acid has a maximum absorbance at 548 nm by UV spectrometry，and it is correlated properly to its optical density at 548 nm in the range of 14～54 μg with a relativity coefficient of 0.9994.The average recovery was 92.94%showing that the content of triterpenoids in wall-broken Gl extract could be counted according to the standard curve by the method.This method that was proved to be easy，rapid，also had the advantages of stableness and repeatability，it should be used for monitoring the quality of Gl spore powder products.

Ganoderma lucidum spore powder;quantification of triterpenoids;ursolic acid;UV spectrometry

Q93－33

B

1005－7021(2011)01－0091－04

广州开发区经济发展和科技局重点科技攻关计划项目(2009Q-P143)

陈冠州男，助理工程师。主要从事食药用菌及其产品的研究与开发。Tel:020-32079666，E-mail:kcirchan@gmail.com

*通讯作者。Tel:020-87685538，E-mail:xieyizhen@126.com

2010-12-17;

2011-01-20