黄海春季海洋病毒的空间分布特征

何 蕾, 殷克东, 林志芬, 田 甜, 袁翔城

（1. 中国科学院 南海海洋研究所热带海洋环境动力学重点实验室, 广东 广州 510301; 2. 中国科学院研究生院, 北京 100049; 3. 中国科学院 海洋研究所海洋环流与波动重点实验室, 山东 青岛 266071）

黄海春季海洋病毒的空间分布特征

何 蕾1,2,3, 殷克东1, 林志芬1, 田 甜1, 袁翔城1

（1. 中国科学院 南海海洋研究所热带海洋环境动力学重点实验室, 广东 广州 510301; 2. 中国科学院研究生院, 北京 100049; 3. 中国科学院 海洋研究所海洋环流与波动重点实验室, 山东 青岛 266071）

采用荧光显微技术, 报道了春季（2006年4月）海洋病毒丰度在黄海的空间分布, 分析了病毒丰度与细菌丰度、叶绿素a浓度、温度和盐度的相关关系。研究结果表明, 黄海表层水中病毒丰度的变化范围为 1.08×107～9.90×107个/mL, 平均值是 5.62×107个/mL±2.28×107个/mL, 细菌丰度的变化范围为0.01×107～0.16×107个/mL, 平均值是 0.07×107个/mL±0.03×107个/mL, 病毒丰度大于细菌丰度两个数量级。叶绿素a浓度表层的变化范围为0.09～4.94 µg/L, 平均值是0.75 µg/L±0.84 µg/L, 最高值出现在长江口附近。通过相关性分析, 在黄海春季, 细菌可能控制着病毒的空间分布, 并且病毒的空间分布受盐度影响较小, 受温度影响较大。

黄海; 病毒丰度; 细菌丰度; 空间分布

海洋是地球生命的起源地。海洋生命的种类涵盖了从病毒到高等哺乳类的各个层次。游离的病毒和细菌存在于海水当中已经是众所周知的事情, 自从Azam等[1]科学家们在1983年提出微生物食物环的概念以来, 浮游细菌的生物学和生态学研究成为生物海洋学最活跃的前沿领域之一。而在最近20年对海洋病毒的研究中, 人们不但发现在海洋中病毒数量是最丰富的[2], 而且还发现病毒可以感染海洋中大部分的生物[3-5]。这些重大发现使人们对海洋病毒在生态环境方面的重要性有了重新认识, 同时也引起了各国研究学者对海洋病毒的强烈关注。研究结果表明海洋病毒是海洋生态系统中的活跃分子,不仅是微生物食物环和生物地球化学循环中的重要角色[2], 还在赤潮控制[6], 基因转移[7]和全球气候变化[2]等方面起着非常重要的作用。

目前, 国际上已普遍采用荧光显微技术对水体中病毒生物量进行检测[8]。Hara等[9]首次利用荧光显微计数法检测了日本大阪湾和Otsuchi Bay两个湾域中游离病毒的丰度, 测得病毒丰度为 0.12×107～3.5×107个/mL。Hennes等[10]对墨西哥西部海湾表面水体中的病毒生物量进行检测, 病毒丰度为 1×107～12×107个/mL。Noble 和 Fuhrman[11]对不同海水中病毒生物量进行计数, 其范围为 0.03×107～15×107个/mL。He等[12]首次报道了中国南海陆架海区表层水中病毒丰度为 1.41×107个/mL±0.65×107个/mL。赵苑等[13]对胶州湾浮游病毒进行了研究, 胶州湾浮游病毒的丰度为 0.48×107～22.78×107个/mL 。

黄海是颇为重要的陆架海区, 也是世界上最典型的半封闭性陆架浅海之一。 它与其他陆架海区一样, 是人类活动、经济开发最为集中的地带, 由于黄海水深较浅, 紧邻陆地, 多条大河直接或间接注入,所以营养物质十分丰富, 生物资源蕴藏量很高, 一向以生产力高而著称[14]。在这一生态系统中, 海洋浮游病毒的生态效应如何, 现在并不清楚。本文利用荧光显微技术对黄海的病毒丰度进行计数, 并分析病毒丰度与其影响因子的关系, 探讨病毒丰度在黄海生态系统中的分布特征及其机制, 以期为黄海生态环境的研究及改善提供基础资料。

1 材料与方法

2006年4月“东方红2号”科学调查船在黄海进行了海上大规模调查, 调查范围为北纬 32°31′～39°12′, 东经 120°45′～124°, 共设 41 个站位。（图 1）

需要测量获得的参数有温度、盐度、叶绿素、细菌丰度和病毒丰度。使用Sea-Bird SBE CTD 仪器来获得水体的温度和盐度。水样各采样点均用 2.5L的Niskin采水器获得。叶绿素a水样采样参照《海洋调查规范》（海洋生物调查和化学调查）, 用Turner Designers 700萃取荧光法测定[15]。

图1 2006年4月黄海站位Fig. 1 Locations of the sampling stations in the Yellow Sea during April 2006

病毒样品取 1 mL水样用戊二醛（终浓度 0.5%）黑暗固定15 min, 然后取0.8 mL样品过滤到0.02 μm氧化铝膜（Whatman, Maidstone, England）上, 干燥后,用 0.25% SYBR-Green-I染色, 并在黑暗中放置 15 min, 薄片制好后放在 −20 ºC下保存。样品在一个月内用荧光显微镜（OLYMPUS BX41 microscope,×1000 ）进行拍照计数[10]。细菌样品取10 mL水样用甲醛（终浓度 5%）固定保存, 回到实验室用4′6-diamidino-2-phenylindole（DAPI）染色, 用直径为25 mm, 孔径0.2 μm的黑色核孔滤膜（black Nucleopore filter）进行抽滤, 将滤膜放在载波片上, 滴一滴浸油（immersion oil, Germany）, 盖上盖玻片, 再滴少量浸油, 用荧光显微镜（OLYMPUS BX41 microscope,×1 000 ）进行拍照计数[16]。每个样品随机取至少 10个视野, 计数每个视野中所有的颗粒。

实验数据用SPSS软件分析, 所得实验结果用平均值±标准误差表示, 以P＜ 0.05表示具有显著性差异。图形均使用Surfer软件（Golden software Inc.CO）绘制。

2 结果

图2 黄海2006年4月温度（T）和盐度（S）表层分布Fig. 2 Horizontal distributions of temperature （T） and salinity （S） in the surface layer of the Yellow Sea during April 2006.Circle symbols indicate the sampling stations

图2是2006年4月温度和盐度表层分布图, 表层的温度变化范围为4.50～13.74℃, 平均值是9.01℃±2.27℃。表层的盐度变化范围为 27.87～34.06PSU,平均值是32.20PSU±1.08PSU。从图2中可以看出温度随纬度增加而降低, 南北温度差异达 9℃, 在苏北沿岸有一暖水舌向东北延伸。在海域东南部, 有一较强的暖水舌自济州岛西侧海域向北偏西方向伸展,这一暖水舌表征了传统上认为的黄海暖流。表层盐度的差异有7PSU。在黄海研究区的东南部有一较强的高盐舌自东南向西北伸展。在35°N附近, 主舌锋偏向西, 分出的另一舌锋指向北。这一高盐水舌的分布大致反映了春季黄海暖流的所在位置。在黄海西部, 有3个低盐中心, 一个位于山东外海, 一个在江苏外海, 另一个出现在长江口的东北方。

图3是2006年4月叶绿素a浓度和细菌丰度表层分布图, 叶绿素a浓度表层的变化范围为 0.09～4.94 µg/L, 平均值是 0.75 µg/L±0.84 µg/L。叶绿素a浓度在表层有 3个高值区, 其一在黄海研究区的南部, 近长江口处（4.94 µg/L）, 其他两处在黄海研究区东部, G18（1.80 µg/L）和 G31（1.98 µg/L）站。在辽宁和山东的南部海域, 叶绿素a浓度最低。细菌丰度的变化范围为 0.01×107～0.16×107个/mL, 平均值是 0.07× 107个/mL±0.03×107个/mL。细菌丰度在表层分布上差异很大, 有 1个数量级的差别。北黄海细菌丰度明显比南黄海细菌丰度高, 最高值在北黄海 G35 站（0.16×107个/mL）和 G40 站（0.13×107个/mL）。

图4是2006年4月病毒丰度和病毒丰度与细菌丰度的比值（VBR）表层分布图。病毒丰度的变化范围为 1.08×107～9.90×107个/mL, 平均值是 5.62×107个/mL±2.28×107个/mL。病毒丰度在平面分布上差异也很大。最大值在南部G10站（9.90× 107个/mL）, 其次是G7站（8.85× 107个/mL）, 第三大值黄海北部G5站（8.52×107个/mL）。VBR 的变化范围为 20.93～427.90,平均值是103.52±87.57。VBR的表面分布差异也很大, 最大值东南部 G28（427.90）, 最小值在黄海研究区的东北部G33（20.93）。

图3 黄海2006年4月叶绿素a（Chla）浓度和细菌丰度（BA）表层分布Fig. 3 Horizontal distributions of chlorophylla（Chla） and bacterial abundance （BA） in the surface layer of the Yellow Sea during April 2006. Circle symbols indicate the sampling stations

3 讨论

3.1 病毒丰度计数方法的选择

病毒生物量的正确估计对于微生物生态研究是非常重要的。当前, 海洋病毒丰度的计数有如下4种方法: 透射电镜计数法、荧光显微镜计数法、流式细胞仪计数法和最大可能数法。在这4种方法中, 流式细胞仪法、荧光显微镜法和最大似然数法比较简单易行, 而透射电镜法则较难操作。透射电镜是最早也是较为普遍使用的计数病毒丰度的方法, 第一个高病毒丰度的数据就是用透射电镜法获得的[17-18]。但透射电镜法由于采样的不均匀和低的探测极限等技术原因而低估病毒丰度[9-11,19-20]。最大似然数法简单易行, 但精确度不高。流式细胞仪法是现在比较流行的方法, 可以区分病毒和细菌, 但对仪器的灵敏度要求高。而荧光显微镜法尽管无法消除小的细菌和大的病毒相互重叠所带来的误差[21], 但由于该方法的快速, 使之越来越频繁地用来估计病毒丰度, 而且样品的制备完全可以在船上完成, 大量样品使成本更低, 可以收集更多的数据, 也增加了统计的精确度[22-23]。所以本研究采用荧光显微镜法来计数病毒丰度。

图4 黄海2006年4月病毒丰度（VA）和病毒细菌比（VBR）表层分布图Fig. 4 Horizontal distributions of viral abundance （VA） and viruses to bacteria ratio （VBR） in the surface layer of the Yellow Sea during April 2006. Circle symbols indicate the sampling stations

3.2 病毒丰度与其他海域的比较

最近由于报道了在自然水体中游离病毒颗粒的大量存在, 微生物学家用不同的方法计数病毒在水生环境中的数量。Wommanck等[24]总结了用不同的方法在不同的水生环境中病毒的数量, 其变化范围为104～108个/mL, 在生产力高、富营养的环境中, 病毒丰度也高; 在空间分布上呈现近岸丰度高、远岸丰度低的特点。黄海是颇为重要的陆架海区, 一向以生产力高而著称[14], 病毒丰度为1.08×107～9.90×107个/mL, 平均值是 5.62×107个/mL±2.28×107个/mL。Hara等[9]首次利用荧光显微计数法于1987年9月检测了日本近岸 Osaka湾游离病毒的丰度, 测得病毒丰度为 3.5×107个/mL, Hennes等[10]与 Weinbauer等[19]使用不同的方法分别测墨西哥湾的病毒丰度为1.0×107～12×107个/mL 和 0.03×107～7.9×107个/mL,与我们测得的结果非常相近。由于黄海是富营养海区, 而南海是贫营养海区, 所以黄海病毒丰度显著高于南海病毒丰度（0.35×107～2.51×107个/mL）[12]。

3.3 病毒丰度与其影响因素的关系

病毒是由一个核酸分子（DNA或RNA）与蛋白质构成的核酸-蛋白质的复合体。它虽然具备了生命活动的最基本特征（复制与遗传）, 但不具备细胞的形态结构, 是不“完全”的生命体, 它们的主要生命活动必须在宿主细胞内才能表现, 因此, 病毒是彻底的寄生物[25]。海洋病毒的宿主细胞主要是浮游植物和海洋细菌。Boehme等与Jiang等报道美国佛罗里达的 Tampa湾病毒丰度与叶绿素a浓度显著相关,说明浮游植物是病毒的主要宿主, 可能的解释是富营养水域浮游植物生物量的增加导致了病毒丰度的增加。然而, 在大部分的海洋环境中, 研究结果表明病毒丰度与细菌丰度有着显著的相关关系, 说明细菌是病毒的主要宿主, 细菌的丰度控制着病毒丰度[26-37]。从本研究的数据分析（表 1）看, 病毒丰度与细菌丰度呈显著的负相关, 而与叶绿素a浓度没有显著的相关关系, 说明细菌很有可能是病毒的宿主, 影响着病毒的空间分布。从图3和图4中细菌丰度和病毒丰度的表层分布图看, 细菌丰度少的地方病毒丰度多, 而叶绿素a浓度有高有低。例如在黄海南部, 近长江口海域, 由于受长江径流影响, 带来大量的营养盐, 刺激浮游植物生长, 所以叶绿素a浓度在长江口附近比较高。由于浮游植物生长旺盛, 对细菌的生长有所抑制而对病毒没有影响, 所以细菌丰度相对较低, 而病毒丰度较高。

表1 表层病毒丰度与温度、盐度、叶绿素a浓度和细菌丰度的相关关系Tab. 1 Simple correlation coefficients between virus, bacterial abundance and environmental parameters in the surface layer

海洋细菌与浮游植物的生长繁殖有密切的关系,一方面, 细菌能够吸收浮游植物产生的溶解有机物进行二次生产[38], 在为促进自身生长和增殖提供碳源的同时[39], 也为浮游植物的生长提供必要的有机营养和生长因子, 并调节浮游植物的微生长环境[40];另一方面, 细菌可以通过参与生物竞争、分泌特殊物质等途径抑制浮游植物的细胞生长, 甚至裂解其细胞[41]。从表1中可以看出, 叶绿素a浓度与细菌丰度呈显著的负相关关系, 在图3中, 叶绿素a浓度高的地方细菌丰度低, 说明在黄海浮游植物和细菌的生长有一定的相互抑制作用。

病毒丰度的分布除了受生物因素（浮游植物, 细菌）影响, 同时也受非生物因素（温度, 盐度）影响。从表1中可以看出, 病毒丰度、叶绿素a浓度和VBR值与温度呈显著的正相关, 细菌丰度与温度呈显著的负相关, 说明在春季, 由于太阳辐射, 使表层水增温, 而且由于纬度的关系, 越往南增温越大, 所以合适的温度条件为生物生长提供条件。由于浮游植物指数生长时, 抑制细菌生长, 所以病毒就会选择感染大量的浮游植物, 而使病毒数量增加, 也就导致了VBR增加。而病毒丰度, 细菌丰度和VBR与盐度之间没有显著的关系, 说明盐度对这些参数的影响并不明显。根据以上相关关系分析, 黄海海洋病毒的空间分布受盐度影响较小, 受温度影响较大。

病毒在海洋生态系中的重要作用日益受到重视,本文报道了海洋病毒在黄海的空间分布特征, 分析了病毒、细菌、浮游植物、温度和盐度的相互影响关系, 初步探讨了海洋病毒在黄海生态系统中的作用, 为黄海生态环境的研究和了解提供资料, 为更全面的研究黄海海洋生态系统打下基础。

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Received: Nov., 20, 2009

Key words:Yellow Sea; Viral abundance （VA）; Bacterial abundance （BA）; spatial distribution

Abstract:The spatial distribution of viral and bacterial abundance as well as chlorophylla（chla） concentrations were investigated during spring （April 2006） in the Yellow Sea. The viral abundance varied from 1.08×107/mL to 9.90×107/mL with the average of 5.62×107/mL±2.28×107/mL in spring, exceeding bacterial abundance （from 0.01×107/mL to 0.16×107/mL with the average of 0.07×107/mL±0.03×107/mL） by two order of magnitude. The chlorophyllaconcentrations varied from 0.09µg/L to 4.94 µg/L with the average of 0.75µg/L±0.84µg/L, and the highest concentration occurred near the Changjiang River estuary. A multiple regression analysis showed that the bacteria and temperature were the main factors governing the viral spatial distribution in the Yellow Sea.

（本文编辑:张培新）

Spatial distribution of viruses in spring in the Yellow Sea

HE Lei1,2,3, YIN Ke-dong1, LIN Zhi-fen1, TIAN Tian1, YUAN Xiang-cheng1
（1. Key Laboratory of Tropical Marine Environmental Dynamics, South China Sea Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301, China; 2. Graduate School of the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3. Key Laboratory of Ocean Circulation and Waves, Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China）

Q938

A

1000-3096（2011）02-0010-07

2009-11-20;

2010-04-11

国家自然科学基金重大项目（40490264）; 国家自然科学基金面上项目（40676020）

何蕾（1976-）, 女, 黑龙江省大庆市人, 博士生, 主要从事海洋生态学研究, E-mail: leihe@scsio.ac.cn