结核分枝杆菌环介导恒温扩增（LAMP）快速检测方法的评价

戴广明 曹以诚 杜正平 陈洵 黄曙海 逄宇 周杨 黄海荣 赵雁林

（1.北京结核病胸部肿瘤研究所 北京 101149；2.华南理工大学 广州 510640；3.广西疾病预防控制中心 南宁 530000）

细菌学检查是发现结核病传染源的主要途径和手段，是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据。但由于敏感性低或所需时间过长等原因，致使结核病细菌学检查一直不能满足临床诊治的需求，存在延误诊断和误诊情况，同时也耽误了患者得到及时治疗的时间，影响了治疗效果，也使得疾病的传播难于控制。因此，缺乏早期、准确和廉价的诊断技术是制约全球结核病控制的严重障碍。

近年发展起来的环介导等温扩增技术（LAMP），完全突破了传统分子生物学检测技术需要昂贵仪器设备以及繁杂操作的限制，给分子生物学诊断技术的廉价普及带来了希望。该方法最初是由Notomi等［1]设计来用于病原微生物的检测，技术的工作原理是利用4条不同的特异性引物识别靶基因的6个特定区段，在等温条件下进行扩增反应。基因的扩增和产物的检测可一步完成，扩增效率高，可在15～60min扩增109～1010倍。所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有、无来判别。结果的判断很简单，主要有以下两种方式：（1）反应结束后直接在紫外灯光下判读有无扩增反应产物形成；（2）核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2＋结合，产生副产物焦磷酸镁沉淀，应用浊度仪检测沉淀浊度来判定［2]。由于方法简单易行，即使是没有分子生物学实验经验的技术人员也只需1周的训练就可掌握。

本文对国内建立的结核分枝杆菌环介导恒温扩增（LAMP）快速检测方法进行了介绍和评价，结果如下。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 本室保存的31株分枝杆菌标准菌株，48株临床结核分枝杆菌。

1.1.2 结核分枝杆菌（LAMP法）基因快速检测试剂盒（以下简称LAMP检测试剂盒）由我们和华南理工大学共同研发，基因组DNA纯化试剂盒（Genomic DNA Purification Kit）购自Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 检测目标菌株和靶标引物 结核分枝杆菌基因快速检测方法的目标菌株确定为结核分枝杆菌复合群，包括结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛结核分枝杆菌（Mycobacterium bovis）、非洲结核分枝杆菌（Mycobacterium africanum）和田鼠结核分枝杆菌（Mycobacterium microti）。根据相关文献报道［3]和预实验，靶标确定为编码DNA解旋酶B亚基的gyrB基因，通过序列分析获得保守区域设计引物（图1），内引物为FIP和BIP，外引物为F3和B3（引物设计软件为华南理工大学开发的LAMP引物设计专用软件）。引物序列为FIP：ACCGTTGACCCCGTCTTCTTGttttAGAAGTCGGAACCCCT 和 BIP：ATACGACTTCGAAACCGTCGCCttttGGTCAGCCCCTTGTTGAG， F3： GGGTACGAGTGGTCTCAGG，B3：CGTCTTGGGTCACCCTCT。

1.2.2 DNA模板制备 取对数生长期的分枝杆菌标准菌株和临床结核分枝杆菌，用灭菌蒸馏水分别悬浮于1.5ml离心管中高温灭菌后，8000r／min离心5min，取上清液转移至另一离心管中作为粗制模板DNA。或将上清液和细胞沉淀用基因组DNA纯化试剂盒（Genomic DNA Purification Kit）提取基因组DNA作为精制的模板DNA。

图1 目标菌gyrB基因序列高度一致的保守区域（红框中是引物识别靶基因的6个特定区段）

图2 LAMP反应结果（绿色的是有发生特异性扩增的阳性管，橙色的为阴性管）

1.2.3 LAMP扩增反应 结核分枝杆菌（LAMP法）基因快速检测试剂盒包括20支LAMP反应管和阳性标准管、阴性标准管各1支。每支LAMP反应管为1个LAMP反应体系，分为大小2个腔。大腔含有1.6μmol／L FIP引物、1.6μmol／L BIP 引物、0.4μmol／L F3 引 物、0.4μmol／L B3 引 物、1mol／L Betaine溶液、6mmol／L MgSO4溶液、8U Bst DNA 聚合酶、1.6mmol／L dNTP溶液、2.5μL 10×Thermo Pol Buffer，小腔含2μL核酸染料，最后上面覆盖一层石蜡油（25μL）以防止污染。阳性标准为卡介苗核酸溶液，阴性标准为样品处理液。将粗制模板DNA 2.5μL或精制模板DNA 1μL加入LAMP反应管的大腔底部，置65℃恒温反应60min即可。每次反应都应加阴性标准模版、阳性标准模版作为对照。

1.2.3 PCR扩增反应 在50μl PCR反应体系中进行扩增反应，含有10×缓冲液5μl，上下游引物各 0.1μM （F3：GGGTACGAGTGGTCTCAGG，B3： CGTCTTGGGTCACCCTCT ）， 0.2mM dNTP，2μM MgCl2，1.5UTaq DNA 聚合酶及100ngDNA模板。在PE－9700扩增仪上94℃预变性5min后，进行30次下述循环：94℃1min，58℃1min和72℃1min，72℃延伸7min。最后取5μl PCR扩增产物，在1.5%琼脂糖凝胶（其中含40μl／ml溴乙锭）中进行电泳，时间为1h。电泳完毕，用读胶仪拍照，并用标准DNA 1 500bp ladder进行带型大小比较结果判定。

1.2.4 结核杆菌H37Rv基因组DNA稀释实验取结核杆菌H37Rv培养物作为原液，用灭菌蒸馏水悬浮于1.5ml离心管，高温灭菌后，用纯化试剂盒（Genomic DNA Purification Kit）提取基因组DNA作为底液作10倍梯度稀释，共稀释10个梯度。然后以其做模版进行lamp检测。

1.2.5 重复对照实验 分别由本室实验员和华南理工大学实验员对相同的样品进行重复对照测试。

1.2.6 结果判断 取出反应管，冷却至室温，颠倒LAMP反应管，使大小腔反应物混匀。其结果可以通过肉眼观察到的颜色变化来判断，颜色立即变绿的是有发生特异性扩增的阳性管，变橙色的为阴性管。若阴阳性对照反应管结果与上述情况不符，则本次检测结果无效，应重新检测。

2 结果

2.1 LAMP反应的灵敏度和特异性试验 取本室保存分枝杆菌31株标准菌株和48株临床结核分枝杆菌的DNA模板进行LAMP反应，结果如表1和图2所示。从图2可以看到，颜色立即变绿的是发生特异性扩增的阳性管，变橙色的为阴性管。在相同反应条件下，LAMP方法能迅速的检测出结核杆菌复合群，包括结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、牛分枝杆菌（Mycobacterium bovis）、非洲分枝杆菌（Mycobacterium africanum）和田鼠分枝杆菌（Mycobacterium microti）。华南理工大学的检测结果为56株菌为阳性，23株菌为阴性，其中溃疡分枝杆菌（M.ulcerans）和鸟分枝杆菌（M.avium）不属于结核分枝杆菌复合群的菌株也为阳性。以实验菌株培养和16SrRNA测序结果作为金标，从表2可计算得出特异度为92.0%，灵敏度为100.0%。北京结研所的检测结果为57株菌为阳性，22株菌为阴性，其中耻垢分枝杆菌（M.smegmatis）、副偶发分枝杆菌（M.parofortuitum）和不产色分枝杆菌（M.nonchromogenicum）不属于结核杆菌复合群的菌株也为阳性。从表3可计算得出特异度为88.0%，灵敏度为100.0%。PCR扩增和金标的结果相同，都是54株菌为阳性，25株菌为阴性。

表1 实验菌株PCR扩增和LAMP检测结果

表2 华南理工大学LAMP检测结果a

表3 北京结研所检测结果a

2.1 LAMP反应最低检出限的计算 将结核杆菌H37Rv提取基因组DNA并稀释10个梯度，用LAMP检测试剂盒进行检测，结果第1到第4个梯度的稀释液为阳性，其余梯度都为阴性（表2）。结核杆菌H37Rv基因组DNA原液经紫外分光光度计定量为58ng／ml，从Genbank查结核杆菌基因组大约为4.41Mbp，最后计算得出每个lamp反应体系最低检出限为12个拷贝。

表4 结核杆菌H37Rv基因组DNA稀释液lamp方法检测结果a

3 讨论

从LAMP技术的原理和以上检测结果来看，LAMP方法的灵敏度同现在广泛应用的PCR方法一致，能完全满足目前结核分枝杆菌检测的需要。每个lamp反应体系最低检出限可达到12个拷贝，这一点要优于PCR方法。结核分枝杆菌（LAMP法）基因快速检测试剂盒的目标菌株为结核分枝杆菌复合群，而我们的检测结果中溃疡分枝杆菌（M.ulcerans）、鸟分枝杆菌（M.avium）、耻垢分枝杆菌（M.smegmatis）、副偶发分枝杆菌（M.parofortuitum）和不产色分枝杆菌（M.nonchromogenicum）都不属于结核分枝杆菌复合群的菌株也为阳性。这些实验结果说明，LAMP检测试剂盒可稳定检出目标菌，但部分非目标菌存在不确定的干扰。该方法对非目标菌存在的不确定干扰从序列上分析是不存在的。我 们.LAMP 的 外 引.（F3：GGGTACGAGTGGTCTCAGG，B3：CGTCTTGGGTCACCCTCT）作为上下游引物，常规PCR扩增目的片段。结果发现，实验结果与培养和16SrRNA测序所得的结果一致。据此可确定，溃疡分枝杆菌（M.ulcerans）等5株菌的检测结果为假阳性。

假阳性的产生有很多原因，国内也有类似文献报道［4]。因北京结研所和华南理工大学的实验室都要常规进行分子生物学实验，DNA交叉污染的可能性较大，故推测影响本实验特异性结果的因素很可能为模板的污染问题。实验者可以通过规范的操作和特殊处理来减少污染的机会，比如隔离混合反应液和检测结果的房间，经常进行实验工具和实验台的清洗，和加入dUTP偶联尿嘧啶－N－糖苷酶（UDG）来防止扩增产物的污染［5]。

目前的LAMP技术具有很多优点：（1）恒温扩增，不需特殊试剂，不需预先双链DNA变性。（2）高特异性：应用6个区段，4种引物进行扩增。（3）快速、高效扩增：整个扩增在1h内即可完成，且产率可达到0.5mg／ml。使用环状引物可以在现有的基础上缩短1／3～1／2的时间［6]。（4）不需要昂贵的仪器设备，检测方法简单，结果判定直接。该方法的特点和优势可以使之在基层实验室及现场监测方面广泛使用，在快速检测方面具有光明的应用前景。因此自LAMP技术发明以来，其被广泛的应用于病原体基因检测等领域［7－9]。国外的结核分枝杆菌LAMP快速检测试剂试用结果表明［10－11]，该方法对痰涂片和痰培养都阳性标本的检测灵敏度为97.7%；而对于涂片阴性但培养阳性标本的灵敏度为48.8%；对培养阴性的标本特异性为99.0%。目前，国外此类LAMP快速检测试剂尚未在国内销售，而且观察实验结果需要价格高昂的配套设备，不适于在广大基层实验室开展。为此，我们开发了具有自主版权的LAMP引物设计软件，提高了设计效率和引物成功率。而且通过LAMP反应管的专利设计，彻底解决了“气溶胶”干扰，实现核酸扩增后不开盖判读检测结果，有效避免了交叉污染。

因为该方法主要应用于基层实验室的结核杆菌诊断，所以适用性是关系到该技术能否被广大基层医务工作者接受的关键因素之一。从目前试用情况来看，我们建立的结核分枝杆菌LAMP快速检测方法将操作者的操作步骤降到最少，交叉污染的可能性也降到了很低水平，而且具有所需设备简单、操作容易、价格低廉等优势。因此，LAMP技术的应用，将会大幅度提高结核病患者的发现率，并将对我国结核病控制工作的顺利进行提供有力的保障。

［1] NotomiT，OkayamaH，MasubuchiH，YonekawaT，WatanabeK，Amino N，Hase T.Loop－mediated isothermal amplification of DNA［J] .Nucleic Acids Ices，2000，28（12）：E63.

［2] MoriY，Nagamine K，Tamita N，Notomi T.Detection of loop－mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation［J] .Biochem Biophys Res Commun，2001，289（1）：150－154.

［3] IwamotoT，Sonobe T，Hayashi K.Loop－mediated isothermal amplification for direct detection of Mycobacterium tuberculosis complex，M.aviumand M.int racel lulare in sputum samples［J] .J Clin Microbiol，2003，41（6）：2616－2622.

［4] 黄帆，李琳，林世平，梅国华，山崎伸二，石磊.DNA环介导恒温扩增技术速检测结核分枝杆菌的研究［J] .现代食品科技，2008，24（8）：835－838.

［5] Hellyer TJ，DesJardin LE，Assaf MK，Bates JH，Cave MD，Eisenach KD.Specificity of IS6110－Based Amplification Assays for Mycobacterium tuberculosis Complex［J] .J Clin Microbiol，1996，34（11）：2843－2846.

［6] Nagamine K，Hase T，Notomi T.Accelerated reaction by loopmediated isothermal amplification using loop primers［J] .Molecular and Cellular Probes，2002，16：223－229.

［7] Poon LL，Leung CS，Chan KH，Lee JH，Yuen KY，Guan Y，Peiris JS.Detection of human influenza A viruses by loop－mediated isothermal amplification［J] .J Clin Microbiol，2005，43（1）：427－430.

［8] Imai M，Ninomiya A，Minekawa H，Notomi T，Ishizaki T，Tashiro M，Odagiri T.Development of H5RT－LAMP（loopmediated isothermal amplifiction）system for rapid diagnosis of H5avian influenza virus infection ［J] .Vaccine，2006，24（44）：6679－6682.

［9] Imai M，Ninomiya A，Minekawa H，Notomi T，Ishizaki T，Van Tu P，Tien NT，Tashiro M，Odagiri T.Rapid diagnosis of H5N1avian influenza virus infection by newly developed influenza H5hemagglutinin gene－specific loop－mediated isothermal amplification method［J] .J Virol Methods，2007，141（2）：173－180.

［10] 李启明，侯云德.逆转录环介导等温核酸扩增技术（RTLAMP）在H5N1禽流感病毒基因检测中的应用［J] .病毒学报，2008，24（3）：178－207.

［11] Boehme CC，Nabeta P，Henostroza G，Raqib R，Rahim Z，Gerhardt M，Sanga E，Hoelscher M，Notomi T，Hase T，Perkins1MD.Operational feasibility of using loop－mediated isothermal amplification for diagnosis of pulmonary tuberculosis in microscopy centers of developing countries［J] .J Clin Microbiol，2007，45（6）：1936－1940.

［12] Pandey BD，Poudel A，Yoda T，Tamaru A，Oda N，Fukushima Y，Lekhak B，Risal B，Acharya B，Sapkota B，Nakajima C，Taniguchi T，Phetsuksiri B，Suzuki Y.Development of an inhouse loop－mediated isothermal amplification（LAMP）assay for detection of Mycobacteriumtuberculosisand evaluation in sputum samples of Nepalesepatients［J] .J Med Microbiol，2008，57：439－443.