胡黄连苦苷Ⅰ大鼠在体肠吸收动力学研究

高宏伟，匡海学，阎雪莹

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院，黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

Picroliv为印度胡黄连活性成分胡黄连苦苷Ⅰ(picrosideⅠ，P－Ⅰ)、胡黄连苷制成的标准化制剂。对四氯化碳、硫代乙酰胺、单响尾蛇毒蛋白、土霉素及半乳糖胺等物质引起的肝损伤具有明显的保护作用，其中P－Ⅰ既可以对抗补体介导的肝细胞毒，又可对抗四氯化碳引导的肝细胞毒性［1］。

本实验采用大鼠在体肠吸收模型，建立了HPLC法测定肠循环液中P－Ⅰ的经时浓度，对其在大鼠各肠段的吸收动力学特征进行初步研究，为其提供生物药剂学依据。

1 试验材料

1.1 药品与试剂

胡黄连苦苷Ⅰ(含量97.96%，本实验室提取分离制得，经光谱及核磁共振图谱鉴定结构);乌拉坦(中国上海曹阳第二中学化工厂);苯酚红(天津市新精细化工开发中心);甲醇(色谱纯，美国Dikma公司);其余试剂均为分析纯。

1.2 实验仪器

LC－2010AHT型高效液相色谱仪(岛津公司);Class－VP 6.0工作站(岛津公司);Sartorius BT25S电子天平(德国Sartorius公司);HJ－6A型数显恒温磁力搅拌器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司);HL－3恒流泵(上海精科实业有限公司);pH计(梅特勒－托利多仪器上海有限公司);722型spectrum可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。

1.3 实验动物

清洁级Wistar大鼠，雌雄各半，体质量(200±20)g，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供(许可证号:SCXK(黑)2008004)。

2 实验方法

2.1 Krebs－Ringers肠循环灌流液的配制

NaCl(6.75g/L)，KCl(0.31g/L)，CaCl2(0.37g/L)，NaH2PO4(0.22g/L)，MgSO4·7H2O(0.29g/L)，NaHCO3(1.83g/L)，Glucose(2.2g/L)，上述物质溶解在双蒸水中，调溶液pH值为7.4。

2.2 肠循环灌流液中酚红的含量测定

2.2.1 专属性考察

取肠循环灌流液 0.5mL，加 4.5mLNaOH(0.2mol/L)，以不加酚红的灌流液为空白，使用756型可见分光光度计，分别于200nm～700nm波长范围内进行扫描，酚红在558nm处有最大吸收，P－Ⅰ的最大吸收波长为282nm，表明酚红与P－Ⅰ不产生干扰。见图1。

图1 肠循环灌流液光谱扫描图

2.2.2 酚红标准曲线的制备

精密称定酚红6.25mg，用空白循环灌流液定容至25mL，分别取 0.5，1.0，2.0，4.0，6.0，8.0mL 定容至25mL，使酚红的终浓度为 5、10、20、40、60、80μg/mL，取上述不同浓度的酚红溶液各0.5mL，加入4.5mL NaOH(0.2mol/L)溶液显色，立即于558nm处测定吸光度，以吸光度A与酚红浓度C(μg/mL)进行回归，得酚红测定的线性标准曲线为:A=0.017 5C+0.042 2，相关系数 r=0.999 3。

2.3 肠循环灌流液中P－Ⅰ的含量测定

2.3.1 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18(5μm，250mm ×4.6mm);偶联Dikma EasyGuard II C18保护柱;流动相:甲醇:水(45∶55);检测波长:282nm;流速:1.0mL/min;进样量:20μL;柱温:35℃;灵敏度:0.2AUFS。

2.3.2 P － Ⅰ标准曲线的制备

精密称定P－Ⅰ2.52mg，用经过肠循环2h的K氏液定容至 25mL，按倍数稀释成 0.504、5.04、25.2、50.4、75.6、100.8μg/mL 一系列浓度的标准溶液，0.45μm微孔滤膜过滤，在上述条件下进样20μL，所得峰面积与浓度进行线性回归，得到P－Ⅰ标准曲线方程y=22 213x－12 576，相关系数r=0.999 6。

2.3.3 P－Ⅰ在空白K氏液中的稳定性考察

分别取P－Ⅰ适量，用空白灌流液稀释至不同浓度，置37℃水浴中，并不断搅拌，分别于不同时间点取样，测定峰面积，根据标准曲线方程计算浓度，考察其在空白灌流液中的稳定性，表明对照品溶液在配制后3h内测定是稳定的。结果见表1。

2.4 大鼠在体肠循环灌流实验

选取健康合格Wistar大鼠，实验前禁食不禁水12h，实验时10%乌拉坦10mL/kg腹腔注射麻醉，仰卧，固定于小动物手术台上，沿腹中线打开腹腔，结扎胆总管。分别选取十二指肠(距离胃的幽门1.5cm处开始 15cm)，空肠(距离胃的幽门 25cm处开始15cm)、回肠部位(距离盲肠上行长15cm)作为肠循环灌流部位。在选定肠段两端剪开小口，分别插入软管，扎紧，连接蠕动泵，使“肠段－软管－泵”形成一个闭合回路。开启恒流蠕动泵，用空白的Krebs－Ringers灌流液(不加酚红和测试药物)清洗肠腔至流出液清澈无脏物，泵入空气排净管中液体，然后泵入药液(37℃水浴并搅拌)，灌流速度为2mL/min，循环10min后从储液灌中取样3ml开始计时定为0点，以后每30min取肠循环灌流液，按照“2.2项及2.3项”，测定酚红和P－Ⅰ浓度，分析药物的吸收情况。

3 实验结果

根据胡黄连苦苷Ⅰ肠循环灌流十二指肠、空肠、回肠的实验数值，计算剩余药量，见表2。

表1 P－Ⅰ在空白灌流液中的稳定性考察(n=7)

表2 P－Ⅰ肠循环灌流的剩余药量(M±SD，n=5，mg)

剩余药量对数值与取样时间进行回归，得到线性方程，该方程斜率的绝对值即为吸收速率常数Ka(h－1)［2］，各方程及相关系数见表3。

表3 胡黄连苦苷Ⅰ小肠吸收速率常数(n=5)

由表3可以看出，P－Ⅰ在大鼠小肠吸收速率大小顺序为:空肠＞十二指肠＞回肠，对数据进行方差齐性检验及两两组间t检验，结果十二指肠、空肠、回肠的吸收速率均无显著性差异，表明P－Ⅰ在大鼠小肠中并无特异的吸收部位;根据以剩余药量的对数对取样时间进行线性回归方程中的相关系数r均大于0.9，表明药物浓度在肠道各部位的下降与循环时问呈线性关系，提示P－Ⅰ在大鼠小肠中吸收属于动力学为一级吸收。

胡黄连苦苷Ⅰ大鼠肠吸收动力学的相关参数见表4。

根据文献报道［3］，大鼠表观渗透系数 Papp＜0.03×10－4cm/s和 ＞0.2×10－4cm/s时，分别表示药物难以吸收和易于吸收，由表4可以看出，P－Ⅰ在十二指肠、空肠、回肠中的Papp分别为4.97×10－7cm/s，6.29 ×10－7cm/s，3.24 ×10－7cm/s，提示 P － Ⅰ在肠道中难以被吸收。

表4 胡黄连苦苷Ⅰ大鼠肠吸收动力学的参数(M±SD，n=5)

4 讨论

小肠是口服制剂的主要部位，研究表明，鼠小肠吸收模型与人类小肠吸收模型相似，用大鼠小肠吸收模型所得的数据能够有效应用于人类小肠的预测［4］。

本文采用单向灌流对P－Ⅰ的肠吸收进行了研究，肠段的灌流方法基于灌流前后肠腔内药物浓度的变化，由于小肠不仅吸收药物，同时也吸收或分泌水分导致灌流液的体积变化，本实验通过测定苯酚红的浓度进行校正。

P－Ⅰ在结构上属于环烯醚萜糖苷类化合物，性质不稳定，但其确有保肝利胆的药理作用。实验显示其几乎不被吸收，这就提示我们P－Ⅰ起效的可能不是原型药物，而可能是其在肠道中的代谢产物，具体其在体内的代谢行为还有待于进一步研究。

［1］ 阎雪莹，刁磊，唐晓飞，高宏伟，等.胡黄连提取物的含量测定及其肝保护作用［J］.中医药学报，2009，37(6):13 －15.

［2］ 唐灿.中药肠吸收动力学的研究－灯盏花素肠吸收动力学的研究［D］.成都:成都中医药大学博士学位论文，2004:29－31.

［3］ Fagerholm U，Johansson M，Lennernas H.Comparison between permeability coefficients in rat and human jejunum［J］.Pharmes，1996，13(9):336－342.

［4］ 程锦，狄留庆.在体肠段灌流模型在中药吸收研究中的应用［J］.中国中医药信息杂志，2008，15(2):98－100.