疏肝脂片质量标准研究

李 燕， 晁 愚， 吴威巍， 杨 方， 庄昌龙， 吴 彤*

(1．上海医药工业研究院，上海200040;2．上海方心健康科技发展有限公司，上海200032)

疏肝脂片源于临床经验方舒肝祛脂胶囊，由柴胡、三七、枳实、白术等九味中药组成，具有疏肝消脂、清热化积、行气活血的功效，用于治疗非酒精性单纯性脂肪肝。为有效控制该制剂的质量，本实验按照中药六类新药的注册要求对该制剂进行质量研究。柚皮苷为枳实中的主要有效成分，具有降血脂、抗动脉粥样硬化的生物学活性，能降低胆固醇、减少血栓的形成［1-3］，并且在该制剂中含有量较高，因此采用高效液相色谱法测定其质量分数，同时对柴胡、三七、白术进行定性鉴别。实验方法简单可靠，为该制剂质量标准的制定提供了依据。

1 仪器与试药

1．1 仪器 HP1100高效液相色谱仪(G1322A脱气机，G1311A四元泵，G1316A柱温箱，G1314AVWD检测器，美国HP公司);KQ2200超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司);HHS电热恒温水浴锅(上海医疗器械二厂);BP211D型电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。

1．2 试药 疏肝脂片(批号080625-1，080625-2，080625-3，上海医药工业研究院自制);柚皮苷对照品(批号110722-200610，供定量测定用);人参皂苷 Rg1(批号 110703-200424，供定量测定用);柴胡对照药材(批号 120992-200504);白术对照药材(批号120925-200407)，上述对照品及对照药材均购自中国药品生物制品检定所;柴胡皂苷C对照品(批号080314，上海医药工业研究院自制，纯度﹥98%);乙腈为色谱纯，水为双蒸水，其它试剂均为分析纯。

2 定性鉴别

2．1 柴胡 取本品10片，研细，过75目筛，称取粉末0．35 g，加甲醇10mL，超声提取10min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL超声使成悬浊液，转移至分液漏斗中，以水饱和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。另取柴胡对照药材0．1 g，加甲醇10mL，超声处理10min，滤过，滤液浓缩至约1 mL，作为对照药材溶液;取柴胡皂苷C对照品，加甲醇制成每1 mL含0．5 mg的溶液，作为对照品溶液。再取缺柴胡的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法(2010版中国药典一部附录Ⅵ B)试验，吸取上述4种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-乙醇-水(10∶2∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以2%对二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，60℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无斑点。结果见图1。

图1 疏肝脂片中柴胡薄层色谱图

2．2 三七 取本品10片，研细，过75目筛，称取粉末0．35 g，加甲醇10mL，超声提取10min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL超声使成悬浊液，转移至分液漏斗中，以水饱和的正丁醇提取2次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加甲醇1 mL溶解，作为供试品溶液。另取人参皂苷Rg1对照品，加甲醇制成每1 mL含0．5 mg的溶液，作为对照品溶液。再取缺三七的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。照薄层色谱法(2010版中国药典一部附录ⅥB)试验，吸取上述3种溶液各5μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，晾干，喷以10%硫酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无斑点。结果见图2。

图2 疏肝脂片中三七的薄层色谱图

2．3 白术 取本品10片，研细，过75目筛，称取粉末1 g，加甲醇10 mL，超声提取20 min，滤过，滤液蒸干，残渣加水10 mL超声使成悬浊液，转移至分液漏斗中，以三氯甲烷提取2次，每次20 mL，合并三氯甲烷提取液，蒸干，残渣加0．5 mL甲醇溶解，作为供试品溶液。另取白术对照药材0．1 g，加甲醇10 mL，80℃水浴回流1 h，滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL甲醇溶解，作为对照药材溶液。再取缺白术的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。照高效液相色谱法(2010版中国药典一部附录Ⅵ D)试验，以十八烷基键合硅胶为填充剂;乙腈-水(45∶55)为流动相;检测波长为210 nm，体积流量1mL/min，柱温25℃。吸取上述3种溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，供试品色谱中，应呈现与对照品色谱峰保留时间相同的色谱峰，阴性对照无该色谱峰。结果见图3。

3 定量测定

3．1 色谱条件与系统适用性试验 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;乙腈-水(20∶80)为流动相;检测波长为283 nm［4-7］，体积流量1 mL/min，柱温25℃。理论板数按柚皮苷峰计算应不低于5 000。结果见图4。

3．2 供试品溶液的制备 取本品10片，研细，过75目筛，取粉末约35 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇约9 mL，超声提取20 min，放冷至室温，再加50%甲醇至刻度，滤过，取续滤液，即得。

3．2 供试品溶液的制备 取本品10片，研细，过75目筛，取粉末约35 mg，精密称定，置于10 mL量瓶中，加50%甲醇约9 m L，超声提取20 min，放冷至室温，再加50%甲醇至刻度，滤过，取续滤液，即得。

图3 白术定性鉴别的HPLC图谱

图4 柚皮苷定量测定的HPLC图谱

3．5 标准曲线的制备 精密吸取柚皮苷对照品溶液(0．337mg/mL)适量，以 50% 甲醇分别稀释至 0．168、0．084 2、0．042 1、0．003 37 mg/mL，分别精密吸取上述溶液 20 μL 注入液相色谱仪，测定，以质量浓度对峰面积进行回归，得回归方程为 Y=3．72 ×104X-43．6，r=0．999(n=5)，表明柚皮苷进样量在0．067 4μg～6．74μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

3．6 精密度试验 精密吸取质量浓度为0．084 2 mg/m L的柚皮苷对照品溶液20μL，注入液相色谱仪，重复进样6次，测定，柚皮苷峰面积的RSD为0．22%(n=6)，表明仪器精密度良好。

3．7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液，分别在0、2、4、8 h进样20μL，测定，柚皮苷面积RSD为2．2%，表明供试品溶液中柚皮苷在8 h内稳定。

3．8 重复性试验 取同一批号的样品6份，制备供试品溶液并测定，柚皮苷的RSD为0．96%，表明该试验方法的重复性较好。

3．9 加样回收率试验 取同一批号的样品6份，分别加入一定量的柚皮苷对照品，制备供试品溶液，精密吸取20μL注入液相色谱仪，测定柚皮苷，计算加样回收率，柚皮苷回收率平均值为98．6%，RSD为2．2%，说明该测定方法回收率较好，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

3．10 样品的测定 取3批片剂(批号080625-1，080625-2，080625-3;平均片质量分别为 370．81 mg，370．67 mg，370．33 mg)，每批取2个样品，制备供试品溶液，测定柚皮苷量，3批样品中柚皮苷量分别为 8．64 mg/片、8．60 mg/片、9．18 mg/片。

4 讨论

4．1 柴胡的鉴别方法参考2010版中国药典［8］263，考察不同比例的展开剂，包括乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)，乙酸乙酯-乙醇-水(8 ∶2 ∶1)展开两次，乙酸乙酯-乙醇-水(10 ∶2 ∶1)等。实验结果证明，后两种展开方法均有较好的展开效果，但是乙酸乙酯-乙醇-水(8∶2∶1)需要展开两次，所用时间较长，因此，选择乙酸乙酯-乙醇-水(10 ∶2 ∶1)。

4．2 三七的鉴别方法使用了多种展开剂，包括正丁醇-乙酸乙酯-水(4∶1 ∶5)、三氯甲烷-甲醇-水(13 ∶7 ∶2)下层溶液［9］、三氯甲烷-甲醇-水(13 ∶6 ∶2)下层溶液、三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水(15 ∶40 ∶22 ∶10)下层溶液［8］11等。实验结果证明，3种展开剂均有较好的分离效果，但是由于正丁醇-乙酸乙酯-水系统背景颜色较深，三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水系统不稳定，因此选择三氯甲烷-甲醇-水系统，其中三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)下层溶液展开效果更好，故最终选择三氯甲烷-甲醇-水(13∶6∶2)下层溶液作展开剂。

4．3 实验中曾采用多种提取方法制备白术鉴别的供试品溶液，更换不同的展开系统，均未找到合适的鉴别白术的薄层层析方法，因此，选择用高效液相色谱法对白术进行鉴别［10-11］。

4．4 实验中对柚皮苷的提取时间进行考察，10 min、20 min、30 min柚皮苷的提取率分别为 2．89%、2．91%、2．92%，确定20 min可将柚皮苷提取完全，因此选择超声提取20 min。

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