罗格列酮联合丹参对2型糖尿病db/db小鼠糖脂代谢及转氨酶的影响

杜玉茗 黄海燕 刘利则 于 燕 姚庆春 (吉林省人民医院，吉林 长春 3002)

大量研究证明在糖尿病(DM)人群中脂肪肝的发病率可达70%～80%，被认为是代谢综合征在肝脏的表现。其发病过程与胰岛素抵抗(IR)、氧化应激、炎症等病理变化密切相关〔1～4〕，目前尚无有效治疗方法。本研究拟对C57BL/KsJ.db/db(以下简称db/db)脂肪肝小鼠给予罗格列酮联合丹参进行干预治疗，探讨罗格列酮联合丹参对DM脂肪肝的预防和治疗作用。

1 材料与方法

1.1 药品、试剂及仪器 氯化钠注射液，由长春豪邦药业有限公司生产;丹参冻干粉针，由哈药集团中药二厂生产;罗格列酮由葛兰素史克(天津)有限公司生产。TGL-16B型离心机，由上海安亭科学仪器厂生产;AU2700全自动生化分析仪，由日本Olympus公司生产;GC2012型γ放射免疫计数仪由科大创新股份有限公司中佳光电分公司生产。

1.2 动物分组 4周龄DM模型db/db小鼠30只，SPF级，体重(BW)12～16 g(购于上海斯莱克实验动物有限公司)〔SCXK(沪)2007-0005〕。每笼5只，饲养于标准环境，自由饮食，12 h光照周期。正常喂养1 w，随机分为3组，模型组、罗格列酮治疗(DM-R)组和罗格列酮与丹参联合用药(DM-R+D)组各10只。各组小鼠BW与空腹血糖(FBG)无显著差异(P＞0.05)。

1.3 给药方式 30只db/db小鼠在饲以高热量饮食同时，DM-R组每日罗格列酮灌胃，给药剂量为1.2 mg/kg;DM-R+D组分别通过灌胃和尾静脉注射给药物(每日罗格列酮1.2 mg/kg，每日丹参36 mg/kg)。共观察12 w。

1.4 标本采集 12 w末，测各组小鼠空腹BW后处死小鼠收集血液测FBG、血浆胰岛素(INS)水平、血甘油三酯(TG)、肝功谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(Cr)、过氧化物歧化酶(SOD)，肿瘤坏死因子(TNF)-α。肝脏指数(LI)=肝脏湿重(LW)(g)/宰前活重(g)×100%。

1.5 指标测定 血糖测定采用葡萄糖氧化酶法;血清TG、ALT、Cr采用日本Olympus AU2700全自动生化分析仪测定;血浆Ins测定采用美国BACKman化学免疫发光法，放免试剂盒购于北京福瑞生物工程公司。比色法测定SOD，按南京造成生物工程公司提供的试剂盒说明规范操作。TNF-α采用ELISA法测定，按美国ADL公司生产的试剂盒说明规范操作。

1.6 统计学处理 采用SPSS17.0统计软件，首先用描述性统计和分析研究变量分布，符合正态分布的测定值以±s表示，对偏态分布的变量进行对数转换，使之正态化再进行统计分析。两组间的比较采用t检验，多组间的比较采用方差分析。

2 结果

2.1 第12周末各组小鼠BW、LW、LI的改变 第12周末DMR组和DM-R+D组小鼠LW、LI与模型组相比均显著降低(P＜0.01)。见表1。

表1 各组小鼠BW、LW、LI变化的比较(± s，n=10)

表1 各组小鼠BW、LW、LI变化的比较(± s，n=10)

与模型组比较:1)P＜0.01;2)P＜0.05;与DM-R组比较:3)P＜0.05;4)P＜0.01;下表同

组别 BW(g) LW(g) LI(%)模型组49.17±1.2 2.69±2.64 5.25±0.39 DM-R组 45.27±1.78 1.27±2.231) 3.31±0.4641)DM-R+D组 44.01±1.991) 1.01±1.121) 2.692±0.4021)

2.2 第12周末各组小鼠各指标比较 DM-R+D组较DM-R组 INS、FBG、ALT、TG 明显降低(P ＜0.05)，SOD 明显升高(P ＜0.05)，TNF-α进一步下降(P＜0.01)。DM-R组INS水平显著低于模型组(P＜0.01)，TNF-α、FBG、ALT、TG 水平也有明显降低(P＜0.05)。各组小鼠血常规红细胞、白细胞、血红蛋白及血小板皆无明显异常，各组血Cr皆处于正常范围内。见表2，表3。

表2 第12周末各组小鼠的血浆INS、TNF-α、SOD的水平(± s，n=10)

表2 第12周末各组小鼠的血浆INS、TNF-α、SOD的水平(± s，n=10)

组别 INS(ng/ml) TNF-α(ng/ml) SOD(U/ml)模型组21.23±3.50 23.2±0.35 24.3±3.16 DM-R组 11.50±2.711) 19.83±0.212) 26.2±2.152)DM-R+D组 9.02±2.143) 9.96±0.284) 28.34±1.513)

表3 各组小鼠FBG、TG和ALT的比较(± s，n=10)

表3 各组小鼠FBG、TG和ALT的比较(± s，n=10)

组别 FBG(mmol/L) TG(mmol/L) ALT(IU/L)模型组29.42±4.39 0.88±0.35 137.1±6.18 DM-R组 11.94±1.541) 0.54±0.191) 79.3±6.811)DM-R+D组 9.78±1.573) 0.49±0.143) 60.9±7.303)

3 讨论

自发性2型DM动物模型是指实验动物未经任何有意识的人工处理、在自然状态下发生以高血糖、IR为主要特征的DM模型。db/db小鼠是由美国Jackson实验室于1966年在C57BL/Ks小鼠中发现的携带有DM突变基因(db)的动物，是Leptin受体基因缺陷导致的先天性2型DM小鼠。该品系纯合子小鼠，早期4周龄即出现显著DM症状，具有高血糖、高血脂、IR等特性，其发病过程与人2型DM非常相似。李娜等观察到db/db小鼠高脂饮食后出现肝细胞大片坏死、大量炎性细胞浸润以及纤维组织增生且肝细胞严重脂肪变性〔1〕。故本研究采用C57BL/KsJ.db/db小鼠为实验对象。

IR作为2型DM发病始动因素贯穿病程始终，同时伴发肥胖者，IR尤为突出。近年研究表明，在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)发病机制中IR亦起着重要作用〔2〕，成为T2DM高发NASH独立危险因素。原因在于胰岛素的抑制脂解作用在IR时减弱，游离脂肪酸(FFA)过多产生，经血液循环流入肝脏醋化为TG过多，超过了肝细胞对其氧化利用和合成脂蛋白运出肝脏的能力，使脂质在肝脏沉积引起肝脏脂肪变性。肥胖尤其是由于内脏脂肪沉积引起的中心性肥胖与NASH的发生密切相关。在2型DM所发生的IR基础上，沉积的内脏脂肪使肝脏的胰岛素敏感性进一步下降，2型DM伴发肥胖者IR与NASH之间形成恶性循环。同时，肝细胞内脂肪酸代谢障碍使内质网、线粒体等亚细胞结构发生氧化应激、脂质过氧化，导致肝细胞变性、凋亡以及纤维化〔3，4〕。IR和氧化应激皆可直接使脂肪细胞分泌TNF-α等炎性因子对NASH的发生起作用〔5〕。IR与氧化应激互为因果〔6〕，组成了目前普遍接受的NASH发生机制的“二次打击学说”。

IR的典型表现为高胰岛素血症。罗格列酮是胰岛素增敏剂，其改善肝脏IR作用普遍认为一是通过激活PPARγ使循环胰岛素水平降低，阻断高胰岛素血症对肝脏脂肪合成的诱导作用;二是直接抑制肝细胞脂酰coA合成酶-4的活性，抑制肝脏合成脂肪;三是罗格列酮可抑制脂源性TNF-α的分泌，逆转TNF-α诱导的GLUT-4及PPARγ的下调，发挥改善IR的效应。本研究结果提示罗格列酮通过降低血浆INS水平改善肝脏IR和使TNF-α表达下调对DM脂肪肝的糖脂代谢紊乱及肝功能起到治疗作用。

丹参中具有较强抗氧化能力的成分主要是丹参素。丹参素是各种丹酚酸的基本化学结构。对CCl4诱导的急性和长期肝损伤大鼠给予丹酚酸类化合物Sal A可显著升高肝脏SOD活性，具有抗氧自由基和抗脂质过氧化的作用〔7〕。现代药理学认为丹参可降低肝脏脂类特别是TG含量，并能促进脂肪在肝内氧化，还可扩张血管，改善微循环，增加肝脏血流量以及降低血液黏稠度，能有效消减及逆转肝细胞脂肪变性，促进病情改善和恢复〔8〕。本研究结果提示抗氧化作用与IR改善亦可相互促进。罗格列酮与丹参二者联合对降低血糖、TG及改善肝功能均较单一用药具有显著的修复DM肝脂肪变性作用，这可能与丹酚酸抗氧化应激、抑制炎症细胞因子的产生进一步改善IR有关。本研究为治疗DM脂肪肝提供了新的临床思路，改善IR、抗氧化应激将在NASH、肝细胞凋亡和肝纤维化的治疗中发挥重要作用。

1 李 娜，张 周，冯 颖.自发性2型糖尿病db/db小鼠生物学特性研究〔J〕.实验动物与比较医学，2010;30(1):33-7.

2 Angulo P.Nonalcoholic fatty liver disease〔J〕.N Engl J Med，2002;346:1221-31.

3 Blechacz B，Stremmel W.NASH-nonalcoholic steatohepatitis〔J〕.J Gastroenterol，2003;41(1):77-90.

4 Dichi AM，Li ZP，Lin HZ，et al.Cytokines and the pathogenesis of nonalcoholic steatohepatitis〔J〕.Gut，2005;54(2):303-6.

5 Bellentani S，Bedogni G，Miglioli L，et al.The epidemiology of fatty liver〔J〕.Eur J Gastroenterol Hepatol，2004;16:1087-93.

6 贾文波，许继取，宋方方，等.2型糖尿病胰岛素抵抗和氧化应激反应〔J〕.中国公共卫生，2006;23(7):769-71.

7 Kim JH，Lewin TM，Coleman RA，et al.Expression and characterization of recombinant rat acyl-coa synthetases 1，4 and 5.Selective inhibition by triacsin C and thiazolidinediones〔J〕.J Biol Chem，2001;276:24667-73.

8 Hu YY，Liu CH，Wang RP，et al.Protective actions of salvianolic acid A on hepatocyte injured by peroxidation in vitro〔J〕.World Gastroenterol，2000;6(3):402-4.