灵芝多糖对卵巢癌小鼠的保护作用及其机制

曲红光 曲洪源 高 磊 王 丽

(吉林大学白求恩医学院病原生物学教研室 吉林大学真菌研究中心，吉林 长春 130021)

卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌而列居第三位。卵巢癌的治疗以手术为主，并辅以化疗和放疗的综合治疗。对于大多数患者主要采用手术与化疗联合治疗，但是由于化疗药物严重的毒副作用，极大地限制了其临床应用的范围及效果，因此临床治疗中寻找一种低毒、安全、副作用小的抗肿瘤药物以提高疗效，成为近年来研究的热点。目前，对中药活性成分的筛选及其作用的研究得到了广泛关注〔1，2〕。本研究从中药灵芝中提取灵芝多糖(Ganoderma lucidum polysaccharides，GLP)，研究其对卵巢癌小鼠的治疗作用，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系来源和实验动物 卵巢浆液性乳头状囊腺癌顺铂耐药细胞系(SKOV-3/DDP)由吉林大学病原微生物学真菌中心构建。ICR清洁级小鼠102只，体重18～22 g，雌性，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供，合格证号:SCXK(吉)2009-0001。

1.1.2 药物与试剂 DMEM-F12培养基(Hyclone);特级胎牛血清(FCS)(Biosource);青链霉素(SM-PC)(Hyclone);二甲基亚砜(DMSO)(Sigma);四甲基耦氮唑蓝(MTT)(Sigma);超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)试剂盒和CAT试剂盒;GLP(吉林大学病原生物学·真菌研究中心制备)。

1.1.3 仪器 倒置显微镜，日本OLYMPUS公司生产;GFD200型半自动生化分析仪，山东高密彩虹分析仪器公司生产;LDZ-2型自动平衡离心机，北京医用离心机厂生产。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 SKOV-3/DDP细胞贴壁生长在含10%～20%胎牛血清及100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEMF12培养基中。培养均在5%CO2、饱和湿度及37℃培养条件下进行。实验用细胞均处于对数生长期。

1.2.2 观察免疫抑制小鼠状态和小鼠外周血白细胞水平 取12只5～6周龄的ICR雌性小鼠，体重18～20 g，25℃饲养，正常食水。饲养5 d后将小鼠随机分为两组，每组6只。第一组为空白组，每日腹腔注射生理盐水0.2 ml，连续5 d。第二组为免疫抑制组，每日腹腔注射200 mg/kg环磷酰胺(CTX)，每只0.2 ml，连续5 d，诱导小鼠免疫抑制。每次在行注射前采用微量采血器尾静脉采血，显微镜下计数每立方毫米血液中白细胞总数。通过观察白细胞减少程度确定小鼠是否受到免疫抑制。

1.2.3 建立小鼠腹腔种植瘤模型 取10只同前免疫抑制小鼠，实验首日腹腔注射1×108个细胞/ml SKOV-3/DDP细胞0.2 ml，以后每天测量小鼠体重，观察小鼠一般生存状态。2 w后脱臼处死全部小鼠，剪开皮肤，暴露腹腔，肉眼观察腹腔种植瘤和腹水情况。

1.2.4 构建小鼠卵巢原位种植瘤模型 在无菌条件下，取上述SKOV-3/DDP成瘤小鼠1只，将小鼠10%水合氯醛0.05 ml/10 g麻醉后，取出瘤体，4℃无菌生理盐水漂洗后切成1 mm×1 mm×1 mm组织块待用。取20只上述免疫抑制小鼠随机分为二组，每组10只。空白组:10%水合氯醛0.05 ml/10 g麻醉小鼠，以左或右侧肋骨与股骨之间靠近脊椎骨约0.8 cm处平行脊椎纵行切口，长约1 cm，暴露腹腔，寻找右侧子宫、输卵管和卵巢。小鼠卵巢内注射生理盐水0.05 ml后关腹，分笼饲养7 d，创口愈合后，将同组实验动物合笼饲养3 w。SKOV-3/DDP组:麻醉及手术同前，待找到卵巢后，在解剖显微镜下，用眼科手术剪刀剪开卵巢包膜后，取上述备好的SKOV-3/DDP腹腔种植瘤组织小块缝入卵巢，关腹后，饲养同前。次日开始观察各组小鼠体重、饮食及一般生存状态。4 w后脱臼处死小鼠，解剖肉眼观察卵巢原位肿瘤生长情况。

1.2.5 采用半自动生化分析仪检测血清SOD、GSH-Px和CAT含量的变化，观察灵芝多糖对SKOV-3/DDP肿瘤球卵巢癌原位移植瘤的疗效 取60只前述ICR免疫抑制小鼠，以SKOV-3/DDP细胞建立小鼠原位移植瘤模型。将小鼠随机分为六组，每组10只。空白组，接种肿瘤当日起每日尾静脉注射生理盐水0.4 ml;DDP组，接种肿瘤当日起每日按8 mg/kg腹腔注射无菌DDP溶液，注射体积0.4 ml;GPL对照组，接种肿瘤当日起每日尾静脉注射GPL 0.4 ml(100 mg/kg);GPL低剂量组，接种肿瘤当日开始，每日尾静脉注射GPL 0.2 ml(50 mg/kg);GPL中剂量组，接种肿瘤当日开始，每日尾静脉注射 GPL 0.2 ml(100 mg/kg);GPL高剂量组，接种肿瘤当日开始，每日尾静脉注射GPL 0.2 ml(200 mg/kg)。以上GPL三个剂量组同时按8 mg/kg腹腔注射无菌DDP溶液，注射体积0.2 ml。以上每组药物均连续注射2 w。全部小鼠给药次日开始每天观察小鼠饮食、一般生存状态并测量体重，最后一次注射后3 d脱臼处死小鼠，测量移植瘤最长径(L)和最短径(W)，称瘤重，按公式:V=(L×W2)/2，计算肿瘤体积;按公式:(V治疗后-V治疗前)/V治疗前，计算肿瘤生长指数。所有小鼠眦静脉取血离心待用，观察药物作用前后各组小鼠血清生化学指标SOD、GSH-Px、CAT含量的变化。

1.3 统计学分析 用SPSS13.0软件进行t检验。

2 结果

2.1 小鼠免疫抑制模型的建立 注射CTX后，免疫抑制组小鼠第1、2、3、4、5天白细胞总数与非免疫抑制组比较有显著差异(P＜0.05)。非免疫抑制组小鼠白细胞数未见波动。见表1。

2.2 GLP对SKOV-3/DDP肿瘤原位移植瘤的作用 GPL对照组和GPL中、低剂量组及DDP组SOD、GSH-Px、CAT含量较空白组均一定程度升高，但无统计学差异(P＞0.05);高剂量组各指标含量升高明显，与空白组相比有显著性差异(P＜0.05，P＜0.01)。见表2。

表1 小鼠外周血白细胞水平(n=6，±s，mm－3)

表1 小鼠外周血白细胞水平(n=6，±s，mm－3)

与空白组比较:1)P＜0.05，2)P＜0.01;下表同

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表2 各组药物对小鼠血清SOD、GSH-Px和CAT含量的影响 (n=10，± s，U/L)

表2 各组药物对小鼠血清SOD、GSH-Px和CAT含量的影响 (n=10，± s，U/L)

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3 讨论

在肿瘤实验研究中，根据疾病的表型特征，考虑到生物和遗传因素的影响，建立合理的动物模型非常重要。SKOV-3细胞为人卵巢癌细胞，不易感染小鼠，而有报道其可以感染免疫缺陷或免疫抑制小鼠。本实验通过CTX诱导小鼠免疫抑制，建立卵巢癌的腹腔种植瘤模型和卵巢原位移植模型进行研究〔3，4〕。

CTX是氮芥与磷酰胺基结合而成的化合物，临床常用于治疗各种自身免疫性疾病，可抑制细胞增殖、非特异性杀伤抗原敏感性小淋巴细胞;其主要副作用为骨髓抑制，表现为白细胞减少。所以在实验中检测白细胞水平，可以作为判断小鼠免疫抑制是否成功的主要手段之一。体内动物实验表明，SKOV-3/DDP肿瘤侵染小鼠的卵巢癌移植瘤模型，更能真实地模拟卵巢癌体内生长的转移模式〔5〕。GPL作用于卵巢癌原位移植瘤动物，检测各给药组血清SOD、GSH-Px和CAT的含量变化，结果证实，GPL对卵巢癌小鼠具有保护作用，并增强其对化疗药物的敏感性。综上所述，本研究以人卵巢癌SKOV-3细胞系的DDP耐药细胞株SKOV-3/DDP为研究对象，建立卵巢癌原位移植瘤体内模型，研究GPL及GPL+DDP联合用药对卵巢癌DDP耐药小鼠的治疗，认为GPL对卵巢癌小鼠具有保护作用，与化疗药物联合应用，可以增强对化疗药物的敏感性，为提高卵巢癌的化疗效果开辟了广阔的应用前景。

1 黄芳华，商明红，熊亚婷，等.低分子灵芝多糖体内抗肿瘤活性研究及其作用机制探讨(英文)〔J〕.中国天然药物，2010;3:228-32.

2 李晓冰，徐 荔，刘 彪，等.中药多糖抗肿瘤作用研究进展〔J〕.中国中医基础医学杂志，2010;7:632-4.

3 陈伟强，黄际薇，罗利琼，等.灵芝多糖调节糖尿病大鼠血糖、血脂的实验研究〔J〕.中国老年学杂志，2005;25(8):957-8.

4 周 婷，荣风年.丙戊酸对卵巢癌SKOV3裸鼠移植瘤生长抑制作用的研究〔J〕.医学综述，2010;21:29-31.

5 王 薇，高庆蕾.上皮性卵巢癌组织中金属硫蛋白与肺耐药蛋白的表达及意义〔J〕.中国实用妇科与产科杂志，2004;20(3):152-4.