不同剂量硝酸甘油预处理对缺血再灌注心肌的作用

王群英 刘新伟 杨海燕 何东伟 叶 茂 (重庆医科大学附属第一医院麻醉科，重庆 40006)

缺血预处理(ischemic preconditioning，IPC)是目前人们研究最多也是经大量研究证实可减轻心肌缺血再灌注损伤的有效方法。研究发现，药物预处理也能模拟缺血预处理的机制保护心肌，减轻心肌缺血再灌注(I/R)损伤。硝酸甘油是临床最常使用的血管扩张剂，通过释放NO，激活鸟苷酸环化酶(cGC)发挥作用。近年研究发现，硝酸甘油预处理能够减轻心肌I/R损伤〔1〕，其作用主要是通过增加内源性NO的生成来实现的。NO的心肌保护作用呈剂量依赖性，适量增加缺血组织中NO的含量可以减轻损伤，大剂量则加重损伤。因此，NO供体预处理减轻心肌I/R损伤的量是值得探讨的问题。因此，本文旨在寻找硝酸甘油的一个有效剂量，既不引起血流动力学的明显波动，又能达到减轻心肌I/R损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 雄性SD大鼠32只，体重(275±11)g，由重庆医科大学实验动物中心提供;K-H液(mmol/L:NaC1:118.5、NaHCO3:25.0、KC1:4.75、MgSO4:1.2、KH2PO4:1.2、CaC12:2.5、Glucose:11.1);硝酸甘油注射液:批号 090401L1910，山西康宝生物制品股份有限公司;一氧化氮试剂盒:南京建成生物工程研究所;BCA蛋白定量试剂盒:北京百泰克;cTnI试剂盒:RD公司;离体心脏灌流装置:120101BEZ，Radnoti公司;恒温循环器:9006AA2Y，Polyscience公司;RM 6240B型生理信号采集处理系统:成都仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 SD大鼠32只，随机分为4组(n=8):I/R组、硝酸甘油 2 μg·kg－1·min－1硝酸甘油预处理(PC1)组、4 μg·kg－1·min－1硝酸甘油预处理(PC2)组、6 μg·kg－1·min－1硝酸甘油预处理(PC3)组。

1.2.2 实验方法 大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛1 ml/100 g麻醉，仰卧固定于手术台上，分离出颈动脉，插管，导管另一端与RM 6240B型生理信号采集处理系统相连，开启系统，实时监测大鼠颈动脉血压。采用临床用24 G静脉留置针进行尾静脉穿刺，拔出针芯，见有明显回血及试推生理盐水通畅时，固定留置针，从尾静脉留置针持续1 h泵入硝酸甘油。

1.2.3 药物配置方法 小剂量配置方法:取硝酸甘油1支(规格:5 mg，1 ml)，稀释50倍，再取稀释后的硝酸甘油1 ml，稀释10倍，配置成浓度为10 μg/ml的硝酸甘油，泵注1 h总量为1.2 ml/100 g;中剂量配置方法:取硝酸甘油一支(规格:5 mg，1 ml)，稀释25倍，再取稀释后的硝酸甘油1 ml，稀释10倍，配置成浓度为20 μg/ml的硝酸甘油，泵注1 h总量为1.2 ml/100 g;大剂量配置方法:硝酸甘油2支，取其中1.2 ml，稀释20倍，再取稀释后的硝酸甘油1 ml，稀释10倍，配制成浓度为30 μg/ml的硝酸甘油，泵注1 h，总量为1.2 ml/100 g。

1.2.4 大鼠离体心灌流模型的制备 大鼠腹腔注射肝素1 000 IU/kg，充分肝素化，打开胸腔，迅速取出心脏(剪断主动脉时应远离心脏)，置于95%O2～5%CO2混合气饱和的4℃K-H液中，简单修剪后迅速挂于Langendorff灌注装置上，开启灌注系统，灌注压力约90 cmH2O，心脏逐渐恢复搏动，稳定搏动15 min后，切开左心耳，于左心室内置入带水囊的导管，导管另一端与RM 6240B生理信号采集处理系统相连。心脏稳定搏动15 min，从主动脉灌注4℃冷停跳液2 ml/kg，灌注压力约90 cmH2O，关闭灌注系统，心脏停跳，全心停跳30 min。重新开启灌注系统，灌注95%O2～5%CO2混合气饱和的37℃ K-H液90 min。

1.3 检测指标 实时监测大鼠用药前及用药期间动脉血压的变化情况，并分别于缺血前、再灌注5、15、30 min，记录左室收缩压(LVSP)、左心室压力变化率(±dp/dtmax)和心率(HR)、冠脉流量(CF)的变化情况。再灌注结束，取左心室心肌组织测心肌肌钙蛋白(cTnI)的释放情况及NO含量。

2 结果

2.1 动脉血压变化趋势 PC1与PC2、PC3组比较，PC1组用药前及用药期间平均动脉压(MAP)平稳，无明显波动，PC3组MAP明显下降，PC2组MAP有所降低，但是与PC1组差异不明显。见表1。

表1 各组用药前后MAP比较(n=8，±s)

表1 各组用药前后MAP比较(n=8，±s)

与用药前比较:1)P＜0.05

时间 PC1组 PC2组 PC3组用药前99.2±1.68 100.6±2.75 98.9±1.85用药30 min 97.7±2.18 86.0±1.251) 65.8±1.171)

2.2 心功能、冠脉流量变化情况 与I/R组比较，PC1组HR、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明显升高，CF 明显增加;PC3组 HR、LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax降低、CF 明显减少;PC2组较 I/R 组明显升高(P＜0.05)，但较PC1组无显著性差异(P＞0.05)。见表2，表3。

2.3 心肌组织中cTnI及NO含量的变化 与I/R组比较，PC1组cTnI明显降低(P＜0.05)，PC3组较 PC1、PC2组均明显增高，PC2组cTnI也明显增加，但较PC3组比较明显降低。与I/R组比较，PC1组NO明显增加(P＜0.05)，PC3组NO大量增加(P＜0.05)，PC3组NO 较 PC1组大量增加(P ＜0.05)，PC2组NO较I/R组也明显增加(P＜0.05)，但较PC3组明显降低(P＜0.05)。见表4。

表2 各组心功能比较(n=8，±s)

表2 各组心功能比较(n=8，±s)

与I/R组比较:1)P＜0.05

指标 组别 缺血前 再灌注5 min 再灌注15 min 再灌注30 min HR(次/min) I/R组212.9±9.5 182.9±9.5 178.3±5.90 171.0±7.3 PC1组 214.8±10.4 191.0±9.01) 187.5±9.71) 182.4±11.51)PC2组 208.9±12.3 187.1±7.4 183.3±7.7 177.9±9.2 PC3组 208.3±11.5 176.3±4.71) 171.4±6.51) 161.9±8.61)LVSP(mmHg) I/R组 184.4±13.05 154.4±6.57 150.9±6.56 139.4±6.52 PC1组 186.3±10.99 168.4±14.611) 165.6±13.451) 159.1±14.671)PC2组 182.8±13.77 159.6±14.10 155.0±15.15 149.3±15.91 PC3组 186.8±15.59 143.5±12.661) 136.1±13.231) 126.9±14.881)+dp/dtmax(mmHg/s) I/R组 1 628±80.19 1 117±83.65 1 074±88.28 1 022±91.86 PC1组 1 670±77.49 1 290±91.621) 1 254±86.571) 1 209±79.861)PC2组 1 655±70.69 1 194±97.56 1 142±102.84 1 110±107.18 PC3组 1 644±57.55 1 012±110.021) 960±107.921) 910±109.991)-dp/dtmax(mmHg/s) I/R组 1 537±65.78 1 017±82.76 973±81.61 934±86.35 PC1组 1 563±80.11 1 183±85.781) 1 134±86.191) 1 091±85.281)PC2组 1 555±72.02 1 097±101.21 1 058±95.83 1 007±98.46 PC3组 1 542±53.63 913±106.441) 866.9±114.381) 813±117.351)

表3 各组CF比较(ml/min，n=8，±s)

表3 各组CF比较(ml/min，n=8，±s)

与I/R组比较:1)P＜0.05

?

表4 各组心肌组织中cTnI和NO含量比较(n=8，±s)

表4 各组心肌组织中cTnI和NO含量比较(n=8，±s)

与I/R组比较:1)P＜0.05;与PC1组比较:2)P＜0.05，3)P＜0.05

?

3 讨论

研究发现:无论是内源性还是外源性的NO都能保护心肌，减轻I/R损伤〔2〕。缺血预处理引起eNOS的激活，进而使内源性NO生成增加，进一步引起心肌保护作用。研究发现过度表达eNOS在缺血中可以提高内源性NO含量从而引起心肌保护〔3〕;外源性给予NO供体如SNAP可以模拟预处理的保护机制，减轻心肌I/R损伤，且其保护作用在一定范围内呈剂量依赖性，近生理浓度时保护作用最明显，剂量过高时则产生毒性作用。NO的心肌保护作用主要通过影响活性氧的生成及蛋白激酶C(PKC)的激活，并在线粒体水平抑制线粒体呼吸链的电子传递及抑制线粒体渗透性转运孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)〔4〕的开放等发挥作用。临床相关的 NO供体如硝酸甘油，也具有强大的心肌保护作用。

硝酸甘油在体内代谢产生1，2-二硝基甘油(1，2-GDP)和亚硝酸盐(NO-2)，亚硝酸盐在线粒体内进一步代谢生成NO，亚硝酸盐作为体内NO的一种储存形式，在近生理剂量时具有强大的心肌保护作用〔5〕。研究发现:给予亚硝酸盐使缺血时体内血药浓度达到2.4～960 nmol/L时呈剂量依赖性的保护作用，在接近生理浓度48 nmol/L时的保护效果最明显。随后的研究证实并拓展了研究成果:亚硝酸盐治疗可以通过局部或全身给予预处理心肌组织〔6〕。近来发现:硝酸甘油预处理可以减轻心肌I/R损伤，在大鼠心肌经历I/R前1 d静脉持续1 h给予硝酸甘油2 μg·kg－1·min－1(总量 120 μg/kg)预处理可显著降低心肌梗死面积及室颤室速等的发生，其机制和PKC及mKATP的激活有关〔7〕。有研究报道:在麻醉诱导时用微量泵持续泵入硝酸甘油 0.25 ～1 μg·kg－1·min－1可以明显降低冠心病病人围术期心肌坏死标志物肌钙蛋白(cTnI)的水平〔8〕，减轻心肌损伤。

因此，本实验以 2 μg·kg－1·min－1的剂量作为研究切入点，设计了大、中、小不同剂量(6、4、2 μg·kg－1·min－1)，研究不同剂量的硝酸甘油对心肌组织的作用，研究结果发现:小剂量(2 μg·kg－1·min－1)硝酸甘油持续 1 h 静脉泵入对大鼠MAP 无明显影响，中剂量(4 μg·kg－1·min－1)与之比较差异不明显，大剂量(6 μg·kg－1·min－1)则明显降低大鼠 MAP，明显影响大鼠血流动力学稳定。与I/R组比较，PC1组在各个监测时间点的心功能有明显改善，PC3组明显降低，PC2组无显著性变化;与PC1组比较，I/R组心肌组织中NO含量明显降低，PC2组明显升高，PC3组极显著升高，表明小剂量硝酸甘油(2 μg·kg－1·min－1)预处理可以显著减轻心肌 I/R 损伤，其可能机制是通过提高I/R心肌组织NO的含量达到的。大剂量(6 μg·kg－1·min－1)则加剧损伤，其可能机制是使心肌组织NO生成过度增加，进而激发NO对心肌组织的损伤作用。而4 μg·kg－1·min－1可能是临界剂量，但由于实验剂量选择不是连续性的，可能存在偏差，但是实验结果与引用文献一致:NO供体在治疗疾病的同时，必须考虑其量的问题。

综上所述，小剂量硝酸甘油(2 μg·kg－1·min－1)预处理可以减轻心肌I/R损伤，大剂量硝酸甘油(6 μg·kg－1·min－1)预处理加剧损伤，4 μg·kg－1·min－1预处理则心肌损伤无明显差异。在心肌组织缺血时，NO的含量明显降低，小剂量硝酸甘油预处理对心肌的保护作用可能是通过增加心肌组织NO的生成达到的，但是作为NO供体，在临床使用时必须考虑到其量的问题，NO生成过多则会加重心肌组织的损伤。

1 Mchael H，Hitossi T，Tang X-L，et al.Nitroglycerin induces late preconditioning against myocardial infarction in conscious rabbits despite development of mtrate tolerance〔J〕.J Circ，2001;104:694-9.

2 Otani H.The role of nitric oxide in myocardial repair and remodeling〔J〕.Antioxid Redox Signal，2009;11(8):1913-28.

3 du Toit EF，Genade S，Carlini S，et al.Efficacy of ischemic preconditioning in the eNOS overexpressed working mouse heart model〔J〕.Eur J Pharmacol，2007;556:115-20.

4 Wang G，Liem DA，Vondriska TM，et al.Nitric oxide donors protect murine myocardium against infarction via modulation of mitochondrial permeability transition〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005;288(3):1290-5.

5 Baker JE，Su J，Fu X，et al.Nitrite confers protection against myocardial infarction:role of xanthine oxidoreductase，NADPH oxidase and K(ATP)channels〔J〕.Mol Cell Cardiol，2007;43:437-44.

6 Shiva S，Sack MN，Greer JJ，et al.Nitrite augments tolerance to ischemia/reperfusion injury via the modulation of mitochondrial electron transfer〔J〕.J Med，2007;204:2089-102.

7 Babak Baharvand，Mansour Esmaili Dehaj，Bahram Rasoulian，et al.Delayed anti-arrhythmic effect of nitroglycerin in anesthetized rats:Involvement of CGRP，PKC and mKATP channels〔J〕.Intern J Cardiol，2009;135:187-92.

8 方传奇，王存真，李建中，等.硝酸甘油对冠心病病人围术期心肌肌钙蛋白I的影响〔J〕.中原医刊，2006;33(24):25-6.