4种病毒在细胞上达最大吸附量所需时间测定

张晋强，牛丽，宋美琴，白喜云

（1．山西农业大学 信息学院，山西 太谷030801；2．山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷030801）

近年来，人们对病毒的研究越来越深入，包括在细胞模型上高通量筛选抗病毒药物并且进一步在细胞水平以及分子水平上研究病毒致病机制、药物抗病毒机制等方面进行大量研究［1］。不管是对病毒进行哪方面的研究，确保病毒感染是首要环节，而吸附是启动病毒感染的第一步，也是决定病毒感染成功与否的关键环节。研究药物与病毒作用的时效关系［2］可以从一定程度阐明药物的抗病毒机制，而病毒在细胞上的吸附时间的确定对于阐明药物的抗病毒机制具有一定的指导作用。所以，测定病毒在细胞上达到最大吸附量所需时间对病毒的研究具有重要的价值。

病毒吸附细胞的时间对病毒感染细胞的能力有明显影响，不同的病毒完成吸附过程所需时间不等，一般不超过120min，如西方型马脑炎病毒感染鸡胚成纤维细胞，其30min的吸附率达到了85%；狂犬病毒感染BHK－21细胞，也可在30min内完成吸 附［3］。Ⅰ 型IBDV 在鸡胚 肾 （Chicken embryo kidney cells，CEK）细胞上37℃孵育 75 min时可以达到病毒的最大吸附量；Ⅰ型和Ⅱ型IBDV接种于Vero上37℃孵育70min时可以达到病毒的最大吸附量［4］。但是IBDV在鸡胚成纤维细 胞 （Chicken enbryos fibroblasts，CEF）上、MDV在 CEF上、PRRSV 在 Marc－145上以及PRV在PK－15上达到最大吸附量所需时间至今还未见报道。

本试验将通过观察病毒在细胞上吸附不同时间后产生的细胞病变情况测定这4种病毒在细胞上达到最大吸附量所需时间。

1 材料与方法

1．1 细胞

1．1．1 鸡胚成纤维细胞（CEF）

取9～11日龄的鸡胚，将外部消毒，在超净台内小心取出鸡胚，放在无菌培养皿中，除去头部、翅膀及内脏；剪切成1～2mm3的小块体积，用PBS缓冲液洗涤后置于锥形瓶中，加入0．25%胰蛋白酶消化液，于37℃水浴锅内消化，待组织块呈蓬松茸毛状时终止消化，弃去胰酶并加入适量的培养液，用弯头吸管反复吹打后经200目过滤筛过滤；取少量细胞悬液进行计数，以1×106个·mL－1的细胞密度接种并置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。

1．1．2 细胞系

Marc－145细胞（购自中国兽医药品监察所）的传代：弃去培养瓶中原来的培养液，加入适量PBS冲洗后加入1mL胰酶对细胞进行消化，轻摇细胞培养瓶使瓶底细胞都充分接触胰酶，37℃消化约2 min，弃去胰酶，加入含有10%FBS的培养液后用吸管将细胞单层吹打成细胞悬液，分装后于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养备用。

PK－15细胞（猪肾细胞，购自中国兽医药品监察所）的传代于37℃消化约3～4min，其它同Marc－145细胞。

1．2 病毒

传染性法氏囊病毒（IBDV）（B87株）疫苗，浙江易邦生物有限公司生产，批号为（2007）110572026。将IBDV疫苗毒在鸡胚成纤维细胞上传代2次，按Reed－Muench法［5］测定半数组织培养感染剂量（TCID50）备用。

鸡马立克氏病毒（MDV－1）弱毒疫苗，北京翎羽禽病防治技术有限公司生产，批号为XLYB003。将MDV－1型疫苗毒在CEF上传代2次，测出其毒力备用。

猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）（JXAI－R株）疫苗，广东大华农动物保健品股份有限公司生产，批号为1012001。将PRRSV疫苗毒在Marc－145细胞上扩增后，按Reed－Muench法测定半数组织培养感染剂量（TCID50）备用。

猪伪狂犬病毒（Pig pseudo rabies virus，PRV）购自中国兽医药品监查所的标准毒株。将毒株在PK－15细胞上扩增后，按Reed－Muench法测定半数组织培养感染剂量（TCID50）备用。

1．3 试剂

DMEM培养基，Gibco公司产品，加入四季青胎牛血清，血清浓度达到5%的为细胞培养液、2%为细胞维持液。按照常规剂量加入谷氨酰胺和双抗。胰蛋白酶，用PBS（pH 为7．2～7．4）配制成0．25%的溶液，滤器过滤除菌，分装后－20℃保存备用。

1．4 主要仪器

CO2培养箱（SL shellab，USA），倒置显微镜（OLYMPUS IX81，Japan），96 孔 细 胞 培 养 板（Corning，USA）。

1．5 试验方法

1．5．1 IBDV在CEF上达到最大吸附量所需时间的测定

按照每组4个重复，将CEF细胞数调整至1×106个·mL－1后加入96孔细胞培养板中，每孔100μL，37℃、5%CO2条件下培养24h，弃掉孔内液体，用PBS冲洗3次，按照每孔100μL加入100TCID50的IBDV病毒液，置于培养箱中孵育，分别在孵育15、30、45min、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5、4、4．5、5h后，将病毒液弃去，PBS冲洗3次后加入新鲜维持液。另设病毒对照组（加入病毒液后不做处理）、细胞对照组（不加病毒加维持液）。加样完毕后继续培养并观察细胞病变情况。当病毒对照出现70%～80%的细胞病变时，观察并记录试验孔细胞病变情况。

1．5．2 MDV在CEF上达到最大吸附量所需时间的测定

制备CEF后将细胞密度调整至1．5×106·mL－1，按照500μL·孔－1接种于24孔板，置于37℃、5%CO2中培养24h。将 MDV病毒液按照100PFU·孔－1接种于CEF上，分别在孵育15、30、45min、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5、4．0、4．5、5．0h后，将病毒液弃去，PBS冲洗3次后加入新鲜维持液。另设病毒对照组（加入病毒液后不做处理）、细胞对照组（不加病毒加维持液）。加样完毕120h后观察细胞病变情况。

1．5．3 PRRSV 在 Marc－145细胞上达到最大吸附量所需时间的测定

按照1．5×105·mL－1接种细胞［6］，待细胞长成单层后，接种稀释度为100TCID50的病毒液，100 mL·孔－1，病毒吸附时间从15min至4．0h。每15min为吸附时间间隔，每个时间间隔接种6孔，弃病毒液，PBS冲洗3次，换2%的维持液于5%CO2培养箱37℃继续培养，每天观察CPE情况，待100TCID50病毒对照组病变达70%～80%时，终止试验。

1．5．4 PRV在PK－15细胞上达到最大吸附量所需时间的测定

按照每组4个重复，将PK－15细胞数调整至1×105个·mL－1后加入96孔细胞培养板中，每孔100μL，37℃、5%CO2条件下培养24．0h，倒掉孔内液体，用PBS冲洗3次，按照每孔100μL加入100TCID50的PRV病毒液，置于培养箱中孵育。病毒吸附时间从15min至4．0h。每15min为吸附时间间隔，每个时间间隔接种6孔，弃病毒液，PBS冲洗3次，换2%的维持液于5%CO2培养箱37℃继续培养，每天观察CPE情况，待100TCID50病毒对照组病变达70%～80%时，终止试验。

2 结果

2．1 IBDV在CEF上达到最大吸附量所需时间的测定

吸附了15min、30min、45min试验组细胞病变程度依次增大，但均比病毒对照组细胞病变情况轻微；吸附60min及其后面实验组细胞病变与病毒对照细胞病变情况相当（图1）；结果表明IBDV在CEF上37℃孵育60min时，IBDV的吸附量达到最大值。

图1 各组细胞病变Fig．1 Result of adsorption time of IBDV on CEF

2．2 MDV在CEF上达到最大吸附量所需时间的测定

从吸附15min到120min的试验孔，病变越来越重，至120min时达到峰值，之后不再加深。所以MDV在CEF上37℃孵育120min时，MDV的吸附量达到最大值。

2．3 PRRSV在Marc－145上达到最大吸附量所需时间的测定

当100TCID50对照组的病变达到70%～80%时：吸附时间从15min到60min细胞病变程度递增但均未达到100TCID50对照组病变程度。吸附时间为60min时，细胞病变程度与病毒对照一致。最终确定病毒的最佳吸附时间为60min。

2．4 2．4 PRV在PK－15细胞上达到最大吸附量所需时间的测定

吸附时间从15min到60min细胞病变程度随着吸附时间的延长而加重，但均未达到病毒对照组病变程度。吸附时间大于60min时，细胞病变程度与病毒对照一致，所以确定病毒的最佳吸附时间为60min。孵育75min时可以达到病毒的最大吸附量，Ⅰ型和Ⅱ型IBDV接种于Vero上37℃孵育70min时可以达到病毒的最大吸附量。本实验中37℃条件下孵育测得IBDV病毒在CEF上达到最大吸附量所需时间为60min。与之前报道出现略微差异可能是因为试验所选用的细胞与之前报道试验所用细胞不同以及所用病毒与报道试验所用病毒不同而造成。

有文章报道PRV在Vero细胞上所需吸附时间为1h［6］，在 PK 细胞上吸附1．5h［7］，PRRSV NVDC－JXA1株在 Marc－145上吸附30min［8］，可能由于实验条件、试验所用细胞系以及病毒毒株等差异造成实验结果略有不符；MDV在CEF上吸附2h［9］。本试验测定 MDV在CEF上达到最大吸附量所需时间为120min与报道相符。

在本试验中，随着吸附时间的延长，试验孔病变加重；到一定时间后病变程度不再随着时间的延长而加重，说明病毒吸附量已经达到最大值。不同的病毒完成吸附细胞的时间不等，一般不超过120min［3］。

3 讨论

之前有报道Ⅰ型IBDV在鸡胚肾细胞上37℃

［1］罗俊，滕蔓，樊剑鸣，等．鸡传染性法氏囊病病毒在 DT40细胞中的增殖规律［J］．畜牧兽医学报，2009，40（8）：1276－1280．

［2］Salim MT，Goto Y，Hamasaki T，Okamoto M，Aoyama H，Hashimoto Y，Musiu S，Paeshuyse J，Neyts J，Froeyen M，Herdewijn P，Baba M．Highly potent and selective inhibition of bovine viral diarrhea virus replication byγ－carboline derivatives［J］．Antiviral Research，2010，88：263－268．

［3］徐耀先，周晓峰，刘立德．分子病毒学［M］．武汉：湖北科学技术出版社，2000：67－159．

［4］黄金海，李健强．传染性法氏囊病病毒在细胞中的增殖及其分子机制［J］．动物医学进展，1999，20（2）：20－24．

［5］胡元亮，刘国家，陈玉库，等．中药成分对传染性法氏囊病毒感染细胞的影响［J］．畜牧与兽医，2003，35（12）：8－10．

［6］Iwata K，Naito E，Yamashita K，et al．Takase K ．Anti pseudorabies virus activity of kumazasa extract［J］．Biocontrol Science，2010，15（4）：123－128．

［7］仇微红，张盼锋，李雪，等．大青叶板蓝根等5种清热类中药体外抗伪狂犬病病毒效果［J］．中国兽医杂志，2009，45（11）：37－39．

［8］朱文革，贺云霞，周振成，等．PRRSV NVDC－JXAl株在 Marc－145细胞上增殖条件的优化［J］．动物医学进展，2010，31（6）：66－69．

［9］褚秀玲，苏建青．细胞病变观察法检测人参皂苷及其衍生物抗马立克氏病病毒的作用［J］．中国畜牧兽医，2010，37（3）：170－183．