蒺藜中甾体皂苷对新生隐球菌生物膜形成的抑制作用

李秀丽 田媛 史玉玲 顾俊瑛 刘至昱 李晓建 高飞

(1.同济大学附属上海第十人民医院皮肤科，上海 200072;2.第二军医大学药学院生化药学教研室，上海 200433)

蒺藜(Tribulus terrestris)为蒺藜科蒺藜属植物，其果实为传统中药材，具有平肝解郁、活血祛风、明目、下气、补肾益精的功用，有降压、利尿、抗炎、抗真菌、抗肿瘤的活性。TTS-12是从刺蒺藜中提取的甾体皂苷类化合物，结构为替告皂苷元-3-O-β-D-吡喃木糖 (1→2)-［β-D-吡喃木糖 (1→3)］-［β-D-吡喃葡萄糖 (1→4)］-［α-L-吡喃鼠李糖(1→2)］-β-D-吡喃半乳糖苷，具有很强的抗真菌活性［1-3］。生物膜是一种附着于活组织或无活力的组织表面、由菌细胞自身产生的ECM(extracellularmaxtrix，细胞外多聚基质)包裹的有结构的菌细胞群体，即由ECM以及被其黏连的菌细胞构成。近年来隐球菌生物膜及其在隐球菌感染中的作用也越来越为人们重视。隐球菌生物膜导致其对一些临床常用抗真菌感染药物产生高度耐药性，导致许多系统性、反复性临床感染。因此，本研究观察TTS-12对新生隐球菌生物膜形成的影响并探讨其可能的作用机制，为以后的临床治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 主要试药及仪器

TTS-12由第二军医大学药学院天然药化教研室提供 (纯度为99.6%)，用 DMSO配成所需浓度。MTT(Sigma公司)，2×SYBR Premix ExTaq(TaKaRa公司)。高速冷冻离心机 (Eppendorf)，台式离心机 (80-2B)(上海安亭科学仪器厂)，LightCycler Nano实时定量RT-PCR仪 (上海锐赛科学仪器有限公司)，GeneQuantⅡ核酸定量分析仪(上海精科实业有限公司)。

1.2 菌株及培养液

新生隐球菌标准株B3501(第二军医大学长征医院真菌保藏中心)。RPMI 1640培养液:RPMI 1640(Gibco BRL 公司)10 g，NaHCO 32 g，吗啡啉丙磺酸 (morpholine propanesulfonic acid，MOPS，Sigma公司)34.5 g，加蒸馏水900 mL溶解，用1 mol/L NaOH调pH至7.0，蒸馏水加至1 000 mL，滤过消毒，4℃保存。YEPD培养液:酵母浸膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，蒸馏水加至1 000 mL，高压灭菌后4℃保存。

1.3 新生隐球菌生物膜的构建［4］

将新生隐球菌接种于YEPD培养基，30℃振荡培养过夜(约24 h)。次日离心收集细胞，PBS洗涤3次，重悬于RPMI 1640培养基，以血细胞计数板计数，调整细胞密度至1.0×106/mL，加入6孔培养板内，37℃静置1 h，弃上清，重新加入RPMI 1640，37℃孵育48 h。根据重新加入 RPMI 1640(含或不含TTS-12)将细胞分为不同浓度TTS-12处理组和正常对照组。

1.4 光镜观察生物膜

为比较正常的及经TTS-12(4 μg/mL)处理的新生隐球菌生物膜生物膜形态差异，将新生隐球菌在培养板中按照生物膜形成条件培养72 h后光镜观察。

1.5 MTT法测定生物膜的生长动力学

采用MTT法［5］检测新生隐球菌生物膜的生长动力学。MTT法原理为活的细胞线粒体脱氢酶能够裂解MTT的四氮唑环，使黄色的MTT变为紫色的衍生物 (MTT-formazan)，通过分光光度计测定MTT-formazan吸光度，反映细胞活力。

取经 0.5、1、2、4、8 μg/mL TTS-12 处理并培养72 h的新生隐球菌生物膜，PBS洗去未黏附细胞，加入含1 mg/mL MTT的基础培养基，于37℃黑暗中放置4 h。加100 μL酸化异丙醇定容，用酶标仪测定波长为490 nm处生物膜每反应孔中OD值，以未加TTS-12的正常培养细胞作为正常对照。各孔OD值与调零孔之差代表各孔生物膜的代谢活性，用于统计学分析。

1.6 实时定量RT-PCR检测PMT4基因的表达

采用一步法抽提经 6 组 (分别 0、0.5、1、2、4、8 μg/mL)TTS-12处理组及对照组的生物膜72 h新生隐球菌中新生隐球菌总RNA，检测OD260和OD280值，反转录成cDNA。实时定量RT-PCR循环参数为:95℃ 10 s(变性)，60℃ 20 s(退火)，72℃15 s(延伸)，重复40个循环。熔解曲线(melting curve program)使用60～95℃，加热速率为0.1℃/s。以 β-actin为参照，结果应用软件LightCycler system software ver-sion 3.5(Roche Diagnostics)进行分析。基因表达水平用倍数变化来表示 (2-ΔCt法)。目的基因 PMT4上游引物:5＇TTCTTTGGGACTTGTGGGAG 3＇，下游引物:5＇TTGTGGCGTAAGGTGATAGTGT 3＇。

1.7 统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以(±s)表示。实验结果均来自3组平行或3次重复实验。组间比较采用两两比较t检验。

2 结 果

2.1 新生隐球菌生物膜的形态观察

光镜观察示:经4 μg/mL TTS-12处理后生物膜明显受到抑制，结构疏松(见图1～2)。

2.2 MTT 结果

结果显示(见表1):随着TTS-12浓度的增加，其对生物膜形成的抑制能力增强，第一组0.5 μg/mL TTS-12对生物膜无明显抑制作用 (P＜0.01)。对照组与实验组 (2，3，4，5组)之间及5个实验组之间相比较有明显剂量依赖性抑制作用(P＜0.01)。

2.3 新生隐球菌PMT4基因的表达结果

实时定量RT-PCR检测结果(见图3)表明:与正常对照组 (0 μg/mL)相比，0.5、1、2、4、8 μg/mL TTS-12处理组新生隐球菌PMT4基因mRNA表达水平明显下降，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)，且抑制作用具有剂量依赖性。

表1 不同TTS-12浓度处理的新生隐球菌生物膜MTT值Tab.1 MTT value of Cryptococcus neoformans biofilm treated with different concentrations of TTS-12

图1 未经4 μg/mL TTS-12处理的生物膜体外模型 图2 经4 μg/mL TTS-12处理后的生物膜体外模型 图3 不同浓度TTS-12处理生物膜中新生隐球菌PMT4基因的表达结果Fig.1 Biofilm model without TTS-12 administration Fig.2 Biofilm administerled with 4 μg/mL of TTS-12 Fig.3 PMT4 gene expression of Cryptococcus neoformans biofilm treated with TTS-12 with different concentration

3 讨 论

生物膜是微生物以某些惰性物质或生物材料为依托产生的一种群体生长方式，这种生长方式有助于微生物抵御外界不利因素的影响，对抗药物的杀伤作用，是微生物中普遍存在的生长方式。生物膜的主要特点是明显降低抗真菌药物的敏感性，甚至产生耐药，这也是临床上与生物膜形成有关的感染难以治疗的原因之一［1-2］。近年来，从天然产物中寻找新的抗真菌药物已成为重要的研究方向，我们前期研究发现，TTS-12具有抗真菌作用，可抑制浮游型新生隐球菌生长［6-8］。

本研究结果也显示，TTS-12对生物膜型新生隐球菌亦具有抑制作用，且抑制作用具有剂量依赖性。

新生隐球菌生物膜形成主要包括:黏附、生物膜生长及成熟，其中细胞的起始黏附对生物膜的形成非常重要。Pmt4蛋白对于真菌分泌蛋白和部分膜蛋白的修饰极其重要，缺乏可导致菌株生长率下降、细胞壁不稳定。PMT4基因在新生隐球菌生物膜形成中起重要作用，PMT4值越大，生物膜形成能力越强，PMT4缺陷株生物膜的代谢活性明显低于野生株。在新生隐球菌生物膜的形成过程中起着重要的作用，该基因的缺陷可导致生物膜性质显著改变［4］。本研究测定了经不同浓度TTS-12处理的新生隐球菌生物膜的PMT4基因，PMT4基因表达水平越低，提示PMT4表达水平下降可能是TTS-12抑制新生隐球菌生物膜形成的分子机制之一。

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