硫酸庆大霉素片含量测定的不确定度评估

邢以文

本品为氨基糖苷类广谱抗生素，对多种革兰阴性菌及阳性菌都具有抑菌和杀菌作用。对绿脓杆菌、产气杆菌、肺炎杆菌、沙门氏菌属、大肠杆菌及变形杆菌等革兰阴性菌和金葡菌等作用较强，临床上用于金葡菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、痢疾杆菌、克雷白杆菌、变形杆菌和其他敏感菌所引起的败血症、呼吸道感染、胆道感染、化脓性腹膜炎、颅内感染、尿路感染及菌痢等疾患。本品按照《中国药典》2005年版二部二剂量法［1］检验，所得结果进行不确定度分析。

测量不确定度是衡量分析测试结果的质量的尺度。不确定度越小，分析测试结果越可靠，因此，测量不确定度是测量结果质量的定量表征。根据ISO/IEC17025［2］和CNAS-CL 07:2011《测量不确定度的要求》［3］的要求，检测实验室应该建立并实施测量不确定度评估程序。

1 仪器、试药及菌种

仪器:智能抑菌圈测定仪(CAM-ⅢB型，上海波浦电脑系统工程有限公司);电恒温水浴锅(H.S型，上海医疗器械厂);隔水式电热恒温培养箱(PYX-DHS一40X5型，国营创新医疗器械厂);高压湿热蒸汽灭菌器(LMQ.C型，山东新华医疗器械有限公司);测定抗生素效价用培养皿(直径90 mm)，牛津杯，陶瓦盖等;电子天平(AE240型，Mettler Toledo(中国)有限公司);数字显示移液器(200～1000 μl Finnpipette，芬兰移液器有限公司)。

试药及菌种:磷酸二氢钾(分析纯)，磷酸氢二钾(分析纯)，自配pH7.8磷酸盐缓冲液(简称PBS pH7.8);硫酸庆大霉素片(规格40000 U，批号为20060405，开封制药＜集团＞有限公司);抗生素检定培养基I(pH值为7.8～8.0，北京三药科技开发公司);短小芽孢杆菌［CMCC(B)63202，中国药品生物制品检定所］。

2 方法与结果

2.1 缓冲液、菌悬液及双碟制备 取磷酸氢二钾11.18 g与磷酸二氢钾0.82 g，加水使成2000 ml，滤过，在115℃灭菌30 min，即得磷酸盐缓冲液(pH=7.8)。取短小芽孢杆菌［CMCC(B)63202］的营养琼脂斜面培养物，接种于盛有营养琼脂培养基的培养瓶中，在35℃ ～37℃培养7 d，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85% 以上，用灭菌水将芽孢洗下，在65℃加热30 min，即得短小芽孢杆菌菌悬液。

取直径约90 mm，高16～17 mm的平底双碟，分别注入加热融化的抗生素检定培养基120 ml，使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层;另取抗生素检定培养基I适量加热融化后，放冷至60℃，加入短小芽孢杆菌菌悬液适量(能得清晰的抑菌圈为度，使标准品溶液的高浓度所致的抑菌圈直径为18～22 mm)摇匀，在每一双碟中分别加入5 ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。放置水平台上冷却后，在每一双碟中以等距离均匀放置牛津杯4个，用陶瓦圆盖覆盖，备用。

2.2 标准品溶液的制备 精密称取庆大霉素标准品25.19 mg(638U/mg×20.15 mg=12856U)置25 ml量瓶中，加灭菌水溶解，并稀释置刻度，摇匀(514.240U/ml)。

2.3 供试品溶液的制备 取供试品5片，加少量灭菌水研细，移置200 ml量瓶中，加灭菌水至刻度，摇匀(1000 U/ml)。

2.4 测定方法 照抗生素微生物检定法，使用移液枪分别吸取浓度为10.285、5.142U/ml的标准品溶液和浓度为10U/ml、5U/ml的供试品溶液各275 μl至上述准备好的双碟中的牛津杯内，盖好陶瓦盖，在36℃下培养14～16 h后，使用智能抑菌圈测定仪测量各抑菌圈的直径，并计算含量。

2.5 不确定度评估

2.5.1 建立数学模型

见含量测定公式。

T1:供试品低剂量所致抑菌圈直径或面积

T2:供试品高剂量所致抑菌圈直径或面积

S1:标准品低剂量所致抑菌圈直径或面积

S2:标准品高剂量所致抑菌圈直径或面积

P:估计效价

从检测过程和数学模型分析，不确定度主要来源于标准品、供试品的称量和溶液的配制过程、加液至牛津杯过程中移液枪以及测量用抑菌圈测定仪的误差、最后结果FL值。

图1 不确定度分量分析图

2.5.2 标准品溶液的标准不确定度

2.5.2.1 天平称量引入的不确定度 ①天平线性:实验使用AE240电子天平，依据说明书，线性为±0.2 mg，按矩形分布，故U(m1)= 0.2/=0.12 mg;②天平重复性:AE240电子天平说明书标明重复性为0.05 mg(天平参数)，由于采用减量法称量，故:

2.5.2.2 容量玻璃仪器引入的不确定度 ①25 ml量瓶;a校正:允差:±0.03 ml，中间分布，U(V1)= 0.03/=0.012 ml，b 重复性:由实验求得标准偏差;c温度:ΔV=(2.1 ×10-4-1.5×10-5)×25×(25-20)=0.024 ml

按正态分布U(V3)=0.0122/2=0.012 ml

Urel(V1)=0.072/25=0.0029

②50 ml量瓶:a校正:允差:±0.05 ml，中间分布，U(V1)=0.05/=0.020 ml

b重复性:由实验求得标准偏差U(V2)=0.08 ml

c温度:

ΔV=(2.1 ×10-4-1.5 ×10-5)×50 ×(25-20)=0.048 ml

按正态分布U(V3)=0.048/2=0.024 ml

Urel(V2)=0.086/50=0.0017

③100 ml量瓶:a校正:允差:±0.10 ml，中间分布，U(V1)= 0.10/=0.041 ml

b重复性:由实验求得标准偏差U(V2)=0.08 ml

c温度:

ΔV=(2.1 ×10-4-1.5 ×10-5)×100 × (25-20)=0.098 ml

按正态分布U(V3)=0.098/2=0.049 ml

④5 ml移液管

a校正:允差:±0.015 ml，中间分布，U(V1)= 0.015/=0.0061 ml

b重复性:由实验求得标准偏差U(V2)=0.02 ml

c温度:ΔV=(2.1×10-4-1.5×10-5)×5×(25-20)=0.0049 ml

按正态分布U(V3)=0.0049/2=0.0024 ml

Urel(V4)=0.021/5=0.0042

2.5.2.3 标准品溶液的不确定度 由于使用25 ml量瓶2个，5 ml移液管 2 支，故

2.5.3 供试品溶液的不确定度

2.5.3.1 容量玻璃仪器引入的不确定度

①200 ml量瓶:a校正:允差:±0.15 ml，中间分布，U(V1) = 0.15/=0.061 ml

b重复性:由实验求得标准偏差U(V2)=0.1 ml

c温度:

ΔV=(2.1×10-4-1.5×10-5)×200×(25-20)=0.196 ml

按正态分布U(V3)=0.196/2=0.098 ml

Urel(V3)=0.15/200=0.00075

②100 ml量瓶引入的不确定度

Urel(V6)=0.0010

③50 ml量瓶

Urel(V8)=0.0017

④5 ml移液管

Urel(V10)=0.0042

2.5.3.2 供试品溶液的不确定度 由于使用50 ml量瓶二个，5 ml移液管二支，故

2.5.4 滴加溶液 275 μl数字显示移液器

①校正:允差:± 2 μl，中间分布，U(V1)=2 μl=0.82 μl

②重复性:由实验求得标准偏差U(V2)=0.51 μl

2.5.5 抑菌圈测定

2.5.5.1 智能抑菌圈测定仪

①均匀性:由实验求得相对标准偏差Urel(V1)=0.00037

②重复性:由实验求得相对标准偏差Urel(V2)=0.00052

2.5.5.2 实验结果 测定效价PT=98.6%平均可信限率PT的FL=2.2%

由平均可信限率(PT的FL)，按正态分布 k=2

2.5.6 合成相对标准不确定度的计算

2.5.7 合成标准不确定度的计算

2.5.8 扩展不确定度计算 测量结果符合正态分布，包含

因子k=2，置信概率为9 5.4 5%

U=K×u c(X)=2 ×1.6=3.2

2.6 硫酸庆大霉素片含量的表示 本品含硫酸庆大霉素为标示量的(9 8.6±3.2)%;k=2

3 结论

分析评估不确定度时，首先要尽量考虑产生不确定度的所有来源，因为合成不确定度是由各方面产生的不确定度分量合成而来的。

本方法测量结果的不确定度主要来源于实验结果的平均可信限率(PT的FL值)，这也从客观上反映出抗生素微生物检定法的不足之处，就是微生物实验的重复性相对较差，这是由于细菌生长的不确定因素较多造成的。可见，测量不确定度对于反映测量过程的准确性具有重大意义。本方法能够较为准确的反映出硫酸庆大霉素片含量测定(微生物检定法)的不确定度。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典(二部).北京:化学工业出版社，2005:731，附录8l-84.

［2］中国实验室国家认可委员会.ISO/IEC 17025:2005检测和校准实验室认可准则.中国实验室国家认可委员会，2005.

［3］中国实验室国家认可委员会.CNAS-CL 07:2011测量不确定度的要求.中国实验室国家认可委员会，2011.