张 强, 王 岩, 李克斌, 尹 姣, 曹雅忠*, 刘春琴
(1.吉林农业大学,长春 130118; 2.中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193; 3.沧州市农林科学院,沧州 061001)
暗黑鳃金龟幼虫取食Bt后中肠细胞形态变化的初步研究
张 强1,2, 王 岩1*, 李克斌2, 尹 姣2, 曹雅忠2*, 刘春琴3
(1.吉林农业大学,长春 130118; 2.中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193; 3.沧州市农林科学院,沧州 061001)
本研究利用透射电镜技术观察了暗黑鳃金龟幼虫取食Bt后不同时间其中肠细胞形态变化过程。结果表明:幼虫取食Bt后1~7d中肠不同的组织结构逐渐发生变化,第1天就出现了细胞膜溶解的现象,在第7天细胞膜完全溶解消失;其他器官出现如细胞核核膜溶解,细胞核消失,内质网消失等现象。经过中肠细胞一系列的病变,最终导致幼虫死亡。
暗黑鳃金龟; 蛴螬; Bt; 中肠细胞; 透射电镜
地下害虫种类多、分布广、食性杂、为害严重[1]。因为地下害虫在土中栖息,隐蔽为害,生活世代长,发生规律复杂,是国内外公认的难以测报和防治的重大害虫。长期以来,我国对地下害虫的控制主要依赖化学农药,因而造成农产品和环境污染问题日趋严重[2]。而在地下害虫中又以蛴螬种类多、危害更为突出,蛴螬危害占到地下害虫危害总量的80%,其中暗黑鳃金龟(Holotrichia parallelaMotschulsky)是常见的优势种之一,其发生危害日趋严重[3-4]。
生物农药由于其高效性、不污染环境、无残留等特点,在实际应用中受重视程度越来越高。在生物杀虫剂方面,以苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,简称Bt)的杀虫效果最为显著,由于其杀虫谱广、药效期长[5]、对环境没有影响,成为生物杀虫剂中的首选[6-8]。Bt产生于土壤中,能在土壤中自然繁殖,所以是防治地下害虫的理想药剂之一。Ohba等在世界上首次从Bt菌株中筛选出对金龟子幼虫具有高效杀虫活性的新Bt菌株[9]。近年来国际上对Bt的研究取得了很大的进展,明确了其基本的杀虫机理:Bt产生的伴胞晶体进入敏感昆虫中肠,被中肠的碱性蛋白酶水解激活,释放出抗水解作用的毒素核心片段,特异性地识别并结合到昆虫中肠上皮细胞膜的受体上,结合后毒素的构象发生变化,使毒素能进入细胞膜,之后在细胞膜上形成孔道,破坏了细胞的选择通透性,最终使中肠上皮细胞胀裂,引起虫体死亡[10-12]。
目前国内外关于Bt防治暗黑鳃金龟幼虫的高效菌株鲜见报道,作用机理也不甚明确,而且研究方向主要集中在分子生物学方面,缺乏解剖学和组织学直观上的描述。本研究利用透射电镜技术,从供试虫体取食Bt后中肠细胞病变过程的解剖学和组织病理学的角度,直接观察和描述虫体的死亡原因,为Bt杀虫作用机理的研究提供图像依据。
供试昆虫:田间捕捉暗黑鳃金龟成虫,在室内用榆树叶饲养至产卵,将卵捡出放入塑料盒内孵化,孵化出来的幼虫用马铃薯饲养至3龄初期,待用。
供试Bt菌株:将QC11菌株由中国农业科学院植物保护研究所生物技术组提供的菌体在固体LB平板上画线,30℃培养至芽胞释放,刮去晶胞混合物,用1倍的无菌水悬浮,制成晶胞悬液,待用。
取3mL晶胞悬液加47mL水制成菌悬液,取晒干的土豆丝10g放入其中,浸泡10min。称土300g,将浸泡的土豆丝和菌悬液一起倒入其中,静置泡土20min。将泡好的土豆丝均匀放入已装有供试蛴螬(60头)(暗黑鳃金龟幼虫,下同)的6孔板中,然后将土拌匀,平分到6孔板中,盖好盒盖,放置在28℃的环境中饲养。在处理后的第1、3、5、7、14天各取10头供试虫,观察记录活跃程度、形态变化、取食量变化和死亡虫数等。解剖前4次取样虫体,在解剖过程中目测虫体的表皮变化、脂肪体变化以及中肠变化,用尖嘴镊子触碰,感受其变化程度,并进行相应的描述记录。同时提取中肠,放入固定液中24h后,透射电镜观察细胞结构的变化,并拍摄相应照片记录。
随着幼虫取食带Bt QC11饲料的时间延长,其死亡率也明显增加(图1),即Bt对暗黑鳃金龟幼虫杀虫效果是一个缓慢、持续的过程,这是和化学杀虫剂最大的区别。
图1 暗黑鳃金龟幼虫取食Bt后的死亡率
取食Bt后,幼虫的活跃度随着时间的延长明显降低,但依然有取食的痕迹。虫体表皮的颜色也由初期的乳白色变为蜡黄色,失去光泽(暗黑鳃金龟幼虫在3龄末期表皮呈蜡黄色,但有光泽,与Bt处理过的有明显不同)。表皮变软,失去弹性。
对比空白对照组虫体,亚致死虫体的中肠明显变得脆弱,失去弹性,围食膜部分破损,取食的食物有的和中肠粘连在一起,形成类似于结石状的物体。
对照虫体中肠细胞的内质网结构密集,排列有序(图2a);而处理后达到亚致死状态的幼虫中肠细胞的内质网疏松,部分出现溶解、断裂(图2b)。在死亡虫体的中肠中很难找到内质网(图2c),说明蛴螬被Bt致死后中肠细胞的内质网已经几乎完全溶解。
图2 暗黑鳃金龟死亡幼虫、亚致死幼虫与对照幼虫中肠细胞内质网比较
在亚致死阶段虫体的脂肪体结构变得松散,部分从表皮脱离,附着于中肠上,与中肠发生粘连。
暗黑鳃金龟幼虫取食Bt致死后体色发黑,虫体软化,完全失去弹性和光泽。
致死虫体的中肠比亚致死虫体的中肠变得更易破碎,而且由于围食膜的完全损坏,取食的食物完全和中肠粘连混杂在一起,形成一块块类似结石状的物体,中肠变黑,整个肠体完全失去了正常的生理功能。
与对照相对比,在处理后1、3、5、7d4次取样中处理幼虫中肠的细胞膜发生了明显的变化。处理后1d,中肠细胞膜厚度变薄,细胞核和其他的细胞器无明显变化(图3a);2d后细胞膜出现溶解状,核膜开始溶解消失(图3b);3d后细胞膜基本溶解,核膜消失,细胞核开始溶解,其他细胞器也开始溶解(图3c);4d后细胞膜完全溶解,细胞破裂,细胞核消失,其他细胞器溶解,变得模糊(图3d);而对照中可以清晰地看到细胞膜、细胞核等细胞器(图3e)。
图3 Bt处理后暗黑鳃金龟幼虫中肠细胞膜的变化
在对照虫体的中肠内可以清晰地看到柱状细胞,排列密集(图4a)。而幼虫取食Bt 1d后,其中肠柱状细胞基本上全部松散脱落,且形状变化明显,有的已经开始溶解消失(图4b)。取食3d后柱状细胞全部溶解,变得模糊不清(图4c)。
致死虫体中的脂肪体变化更为明显,大部分脂肪体从表皮脱落,部分与中肠发生粘连,其他溶解,呈流体状。
图4 Bt处理后暗黑鳃金龟幼虫中肠柱状细胞变化
本研究使用的Bt菌株QC11,是国际上第1株针对暗黑鳃金龟幼虫有毒杀作用的菌株,经过生测试验,其杀虫效果显著,尤其是针对暗黑鳃金龟这种日趋严重的优势种群,可以更好地控制其发生和危害。本研究在高效Bt菌株的筛选过程中,发现有大量的非高效菌株,其对暗黑鳃金龟幼虫的致死率大部分在20%~40%之间。虽然没有进行非高效菌株致死虫体的病理观察,但两者死亡虫体的外部特征相同,故可推测非高效菌株对暗黑鳃金龟幼虫的致死病理学与高效菌株的相似,可能非高效菌株的作用时间更长些。
本研究是国际上首次利用透射电镜技术,观察Bt对暗黑鳃金龟幼虫作用机理,获得了相关照片,为今后Bt对暗黑鳃金龟杀虫机理的分子生物学等方面研究提供了充分有力的图像依据。
本项研究所得到的结果与Bt对其他害虫作用机理的研究结果基本相同,都是Bt毒蛋白与中肠细胞作用,破坏其细胞膜的活性,致使中肠损坏,最终导致虫体死亡[13-16],与Bt经典杀虫作用机理的表述基本一致。
虽然透射电镜技术的应用已经成熟,但尚不能满足细胞组织病理学观察的要求。因为在取样和制样过程中,难免对细胞造成一定的损伤,破坏了细胞的某些结构,无法或很难拍摄到病变部位的真实情况,需要大量的切片才能较好地反映病变过程。另外,由于蛴螬生活在地下,在取食的过程中会将土壤一并取食进入中肠,一方面给解剖提取中肠带来了一定的困难;另一方面试虫在取食Bt后其中肠围食膜发生破损,致使中肠内的食物和土壤与中肠混合在一起,形成了类似于结石状的物体,在解剖提取的过程中非常难以分离,影响电镜照片的质量。因此,今后尚需开展更加深入的研究。
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Preliminary analysis of the cellular morphological change in the midgut ofHolotrichia parallelalarvae fed with Bt
Zhang Qiang1,2, Wang Yan1, Li Kebin2, Yin Jiao2, Cao Yazhong2, Liu Chunqin3
(1.Jilin Agricultural University,Changchun130118,China; 2.State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests,Institute of Plant Protection,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing100193,China;3.Cangzhou Academy of Agricultural and Forestry Sciences,Cangzhou061001,China)
Transmission electron microscope was used to observe the cellular morphological changein the midgut of theHolotrichia parallelaMotschulsky fed with Bt.The results showed that when the larvae were fed with Bt from one to seven days,a series of change happened to different parts of the midgut.The cell membrane of the midgut cells dissolved on the first day,and disappeared on the seventh day.Other symptoms observed included:the karyotheca dissolved,the nucleolus and the endoplasmic reticulum disappeared.Through a series of changes in the midgut cells,the larvae finally died.
Holotrichia parallela; scarabaeoidea larvae; Bt; midgut cell; transmission electron microscope
S 476
A
10.3969/j.issn.0529-1542.2011.06.024
2011-01-17
2011-04-24
转基因生物新品种培育科技重大专项(2009ZX08009-030B);公益性行业(农业)科研专项(201003025)
* 通信作者 王岩,Tel:0431-84510942,E-mail:wy62@163.com;曹雅忠,Tel:010-62815619,E-mail:yzcao@ippcaas.cn