噬菌体抗体库技术的研究进展及应用

王凯，刘洪艳，牟玲

(沈阳市传染病院肾综合征出血热研究所，辽宁沈阳110006)

20世纪80年代，随着DNA重组技术的不断发展和抗体基因结构的阐明，产生了基因工程抗体技术。近年来，治疗性单克隆抗体发展迅速，已成为免疫治疗的重要手段。据统计，目前有22个单克隆抗体已经在美国被批准应用于临床治疗，超过200个单克隆抗体已在临床实验阶段，并且保持着每年约14%的增长率［1-2］。抗体库技术问世已20余年，该技术为基因工程抗体领域带来了广阔的应用前景。抗体库技术的核心是通过表型与基因型的偶联，从构建的抗体库中找到编码针对特异抗原的基因。抗体库技术由于筛选容量大、筛选能力强，可在体外表达系统中表达，便于大规模生产，最有意义的是该技术可直接改善抗体的性能，获取高亲和力的抗体，因而成为开发抗体药物最具发展活力的领域［3-4］。

1 噬菌体抗体库的基因来源

已构建的噬菌体抗体库根据其来源可分为2大类，一类为免疫抗体库，另一类为非免疫抗体库。免疫抗体库的抗体基因来源于抗原免疫的个体，因此不需要很大的库容量即可从该类抗体库中筛选到针对某一抗原的特异性抗体。但由于免疫本身的限制性和偏向性，利用免疫抗体库制备针对弱抗原、自身抗原及具有毒性抗原的抗体均无效，而且某一特定的抗体库只能产生针对特定抗原的抗体，不能作为一个广泛应用的平台［5］。

非免疫抗体库不针对特定抗原，而是作为一个无偏向性的筛选平台，因此必须具有很高的库容量和多样性［6］。目前，通过不同途径得到的非免疫抗体库有天然抗体库、半合成抗体库和全合成抗体库。

天然抗体库:其基因主要来源于B细胞，包括前、成熟、记忆B细胞，常从骨髓、脾、淋巴结、外周血中提取。为了获取抗体基因，通常有3种设计思路:①在框架区FRl和FR4或J区(铰链区)设计引物，但此方法在引物区引入的氨基酸的突变可能对抗体的亲和力有潜在影响;②设计套式PCR引物，先在信号肽和C区设计引物，克隆后测序，再在FR1和FR4区根据测序的结果设计引物，可获得完全真实的V区序列，但信号肽序列变化较大，不易设计;③5＇-RACE或3＇-RACE，其中的特异引物可针对C区或polyA区，用此方法也可获得完全真实的V区序列，而且不易漏过可用的抗体基因，可用于通用引物无法扩增的杂交瘤细胞，但操作比较繁琐［7-9］。

半合成抗体库:以人工合成的部分可变区序列与另一部分天然序列组合。Ig轻重链各有3个高变区，其中由V(D)J基因在B细胞个体发生过程中重组形成的CDR3，序列变化大，特别是其长度，是决定抗体特异性的最重要因素，可从5个氨基酸到30多个氨基酸残基。人胚系可变区的基因(含CDR1和CDR2)与通过人工合成编码氨基酸的随机引物置换的可变区中的CDR3组合，在体外模拟V(D)J重组构建，成为半合成抗体库。Winter小组［10］在最初的探索中，采用49个胚系的VH和人工合成的CDR3重组，配以单个Vk基因，构建成库容为2×107的抗体库，后经改造，采用组合感染法，得到库容达6.5×1010的总抗体库，成功地筛选到了多种特异性抗体。

全合成抗体库:此抗体库的出现得益于人类对抗体基因越来越深入的了解。全合成抗体库人为地对抗体序列尤其是关键部位氨基酸序列进行合理设计，减少无效克隆的产生，可获得大量有功能抗体，从而表现出良好的发展优势。Knappik等［11］在2000年报道了第一个全合成抗体库。他们根据抗体可变区的结构特点设计了7个VH和7个VL基因，其CDR为很容易置换的盒式结构，构建了理想的表达载体，该载体不含干扰的酶切位点，所有元件很容易置换，并预留了构建多种工程抗体或多价抗体的元件插入点。CDR的突变和随机化采用了基于三联核苷酸的突变法，7个VH和7个VL可组配成49个子库。他们初步尝试构建了一个容量为2×109的全合成抗体库，对数十种抗原进行筛选，均得到了亲和力较高的抗体。随后一些学者又构建了全合成ScFv噬菌体抗体库［12］及Fab抗体库［13］，选择部分使用频率较高的人抗体胚系基因家族的框架区基因进行人工合成，同时人工设计合成6个半随机CDR区，通过重叠拼接延伸PCR的方法合成抗体基因，使库容明显提高，而且70%以上为有功能的高亲和力抗体。

2 噬菌体抗体库技术的发展关键

2.1 PCR技术的发展

为了大量扩增抗体基因片段，可设计一系列相应引物，根据抗体中某些序列的相对保守性，利用不同的PCR技术简单有效地扩增出全套抗体可变区基因。一旦多样的IgV区基因组能够扩增，从噬菌体抗体库中即能得到针对不同抗原的高亲和力抗体。1998年，Daniele Sblattero等［14］根据人类胚系基因数据库(V BASE)设计一套引物，理论上可以扩增所有可变区基因。随着胚系基因数据的不断完善和发展及PCR技术的成熟，套式PCR、5＇-RACE或3＇-RACE、单细胞RT-PCR不断应用于抗体可变区基因的扩增，使得抗体的多样性有了很大提高［15-17］。

2.2 利用大肠埃希菌成功分泌有功能的抗体片段

抗体分子与抗原的结合，其特异性主要依赖于复杂的立体结构。大肠埃希菌无糖基化功能，不能表达具有效应功能的抗体分子。在大肠埃希菌周质腔中，能够模拟分泌抗体的B细胞内质网内的氧化环境，抗体片段能够有效表达并保持其亲和力。在抗体片段如ScFv和Fab的可变区基因序列的5＇端加入细菌的信号肽序列，抗体片段即可分泌到周质腔，并在那里完成折叠，成为有功能的蛋白质分子。

2.3 有效筛选系统的建立

传统的筛选方法使用固相化的纯化抗原，依赖噬菌体颗粒对目的抗原的亲和力差异来获得较高亲和力的抗体。而目前，可以在体外用完整的固化哺乳动物细胞、原核细胞和组织中的天然抗原筛选噬菌体抗体片段［18-19］，在进行一维、二维电泳后，仍未能纯化的抗原可以通过硝酸纤维素膜/PVDF膜进行筛选，甚至在体内进行筛选。在体内筛选的方法中，噬菌体被注入动物血管内，非特异性地结合在所有器官的内皮细胞上，由于无差异地结合在普通血管上而被稀释，可用灌注的方式来移动其分布，这就使特异性结合在靶器官内皮细胞上的噬菌体被分离出来，再取出该器官，即可得到目的噬菌体。此方法可以识别出器官的差异，但由于伦理学的约束，限制了此类技术的应用和发展。

3 噬菌体抗体库技术的应用

噬菌体展示技术一般用来制备2类抗体:一类抗体是用来识别人细胞的表面抗原的单克隆抗体，这类研究的主要目的是研究细胞蛋白分子的结构和功能，研究疾病发病机理、治疗方法以及肿瘤的治疗。另一类抗体是用来识别病毒表面抗原的单克隆抗体，这类研究的主要目的是治疗病毒性疾病、对病毒性疾病作临床诊断或研究病毒致病机理。

由于膜蛋白密度的差异及膜分子暴露程度的不同，对未知抗原的分离鉴定具有很大困难，因而在很长一段时间内抗体库没有被应用于对肿瘤特异性抗体的筛选［20］。近年来，人们通过改进筛选策略，用肿瘤作为靶抗原已从噬菌体抗体库中筛选出许多肿瘤特异性抗体，利用抗肿瘤相关抗原的单抗与药物前体、酶或细胞因子交联，靶向定位到肿瘤局部，激活药物前体使之转变为细胞毒药物，在肿瘤局部发挥细胞毒作用，以克服药物所致的全身毒副反应，或通过单抗介导提高肿瘤局部细胞因子浓度，研究已显示了较好的靶向治疗效果［21］。在目前尚未发现肿瘤特异性抗原和令人满意的肿瘤相关抗原的情况下，以这种方法筛选抗肿瘤抗体很有价值。Wiiger MT等［22］利用人乳腺癌细胞株PM-1筛选人源全合成单链噬菌体抗体库得到乳腺癌特异性单链抗体scFv173，可与细胞黏附分子CD166/ALCAM特异性结合。scFv173有2种特性:可抑制乳腺癌细胞侵袭基底膜以及降低了肿瘤在小鼠模型中的增长。

在治疗感染性疾病方面，噬菌体抗体库技术已被应用于登革病毒、乙肝病毒、SARS冠状病毒的研究及单克隆抗体的制备。Cabezas S等［23］利用登革病毒单克隆抗体从被感染的Vero细胞中直接捕获病毒颗粒作为抗原筛选人天然噬菌体抗体库，获得了一组特异性噬菌体抗体。Zhang JL［24］构建了抗HBsAg抗体库，得到2株阳性克隆，可溶性的抗HbsAg ScFv可特异性的与HbsAg结合。在SARS的研究中，筛选出2个抗核蛋白单克隆抗体和4个抗刺突蛋白单克隆抗体，其中1个抗核蛋白单克隆抗体可以识别一个人和所有动物都具有的保守的抗原表位，但抗核蛋白单克隆抗体不具有中和性;其中2个抗刺突蛋白S1的单克隆抗体具有很强的中和作用，能够完全阻止SARS冠状病毒对Vero易感细胞的攻击，同时，研究还进一步揭示抗刺突蛋白S1的N479残基是与抗体结合的重要位点，这为SARS冠状病毒感染的诊断和治疗奠定了基础［25］。本法也用于轮状病毒单克隆抗体的制备［26］。

自噬菌体抗体库技术建立以来，这一技术为单克隆抗体的快速规模化制备开辟了一条全新的途径。国内外的一些实验室先后建立了一批不同性质的抗体库。Brekke等［27］报道应用噬菌体展示技术生产的第一个抗体HUMIRA即D2E7(一种能有效控制RA症状，防止关节结构损坏发生的抗体)已经通过了美国FDA的认证。噬菌体抗体库在感染性疾病、自身免疫病、多种癌症及变态反应性疾病的抗体靶向生物治疗方面也得到了广泛地应用。

4 小结

噬菌体抗体库技术生产的人源抗体为人类疾病的诊断和治疗带来了希望。噬菌体抗体对器官移植排斥反应的防治及肿瘤的早期诊断、治疗，以及手术及化疗后晚期肿瘤的辅助治疗均具有广阔的应用前景。不仅如此，噬菌体抗体库技术在抗体人源化、抗体亲和力提高、蛋白质与蛋白质相互作用、蛋白质结构和功能等方面也显示出独特的应用潜力。尽管噬菌体抗体库技术使单克隆抗体的制备变得简单易行，但目前还没有广泛普及并进入临床应用。目前面临的挑战是，如何最大限度减少非特异性结合的同时。最大程度地富集到特异性好、亲和力高的新抗体。随着国内外研究者对抗体库技术的不断改进，噬菌体抗体库技术必将给生物医学研究及人类疾病的诊治带来深远的影响。

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