肺炎支原体P1蛋白的研究进展

赵梦楠，刘宗昂，王舰

(1.中国医科大学七年制94期，辽宁沈阳110001;2.中国医科大学临床医学93期，辽宁沈阳110001;3.中国医科大学病原微生物学教研室，辽宁沈阳110001)

普通人群中约30%的肺炎是由肺炎支原体引起的，肺炎支原体感染引起的呼吸道损害及各种肺外并发症已引起广泛关注。P1蛋白在肺炎支原体感染过程中起到了关键作用。本文针对肺炎支原体P1蛋白的基因结构、致病机制和实验室诊断方法的最新研究进行综述。

1 P1基因结构与分型

1.1 P1的分子结构

MP基因组的全序列分析(NCBL gene bank)表明P1基因可分为A-N共14个区，其中单拷贝区为F、G、L、M 4个区，其余为多拷贝区。由4 884个碱基组成的Pl蛋白结构基因位于MP基因组第180 858～185 741位的单拷贝区，其中A+T含量约46 mol%，该基因的编码产物是由1 627个氨基酸组成的蛋白。P1结构基因受P1操纵子调控。P1操纵子的基因序列是在P1基因和2个开放读码框架(ORF)之间分别插入了12个和5个碱基，即ORF4→P1→ORF6。另外ORF5编码产生P1蛋白;ORF4编码产生一种Mr约为28×103的蛋白质，其作用尚不明确;ORF6编码产生2种Mr分别为40×103和90×103的膜蛋白，其作用与细胞黏附相关。

黏附素P1可以调控致病性肺炎支原体与呼吸道上皮细胞之间的识别作用。P1蛋白基因包含21个编码色氨酸的UGA密码子，而UGA本身又是一个终止密码子，因此这些UGA密码子的存在使P1蛋白在大肠埃希菌中的表达变得困难。为了避免这些问题，可以在大肠埃希菌中表达P1蛋白的2个不同区域—1个N末端(P1-N1)和1个C末端(P1-C1)，这2个区域被认为具有免疫优势，起到黏附素作用。将这些片段中的UGA密码子修饰成UGG，则该基因被克隆后能够在大肠埃希菌中表达。Rama Chaudhry等［1］通过实验定位了P1中的一段关键基因，发现P1蛋白的COOH端富含脯氨酸(最后的26个氨基酸中有13个是脯氨酸)，这可能是其COOH末端附着在黏膜上的原因，与这些序列相邻的基因片段与肺炎支原体黏附素的生物机能相关，且具有高度免疫原性。他们还通过蛋白印迹法发现P1蛋白C末端区域与肺炎支原体IgG抗体呈阳性的患者血清显示明显的相关性，但是N末端相关区域没有显示相关性，这说明C末端区域能产生免疫原。此外有研究表明与P1-C1重叠的P116片段产生的抗体(anti-P116)阻断了肺炎支原体对呼吸上皮细胞的黏附作用，但未能检测出该蛋白与患者血清发生免疫反应。

1.2 P1变异体—孤立岛3

肺炎支原体中新发现的一种P1变异体被称为孤立岛3(isolate 3)。对于这部分基因，不同的学者有不同的见解。Stephanie B.等［2］用HRM(High-resolution melt)分析法对这部分P1基因进行测序，孤立岛3显示为一种以P1为核心的、介于亚型1与2之间的“中间型”基因型。Spuesens E.B.等［3］认为亚型1与2可以根据每个RepMP(P1基因中的重复DNA片段，同时也存在于肺炎支原体基因组的其他部分)的序列类型加以区分，因此亚型1和2代表了进化株的谱系，每一种P1变异株可以解释为RepMP之间的基因组内同源DNA再结合。

但同时Stephanie B.等［2］用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)分析法解释孤立岛3的P1序列，并与RepMP序列进行比较，认为孤立岛3与亚型2中被命名为2b的株是一致的。该序列中被推断为同源DNA再结合的过程把P1基因RepMP中的RepMP2/3-a序列转换成了RepMP-d，因此，根据Spuesens的分类方案，孤立岛3可以被归类为2-P1类型的序列，这种分类与通过PCR限制性片段多态性(RFLP)分析得出的把孤立岛3作为亚型2株的分类方法一致。而Emiel［4］则认为孤立岛3明显不含有介于亚型1与2之间的中间型基因。

2 P1的致病机制

肺炎支原体的发病机制被部分归因于过度的免疫反应，其通过黏附蛋白黏附到相关细胞表面，激发某种信号从而引起特异性细胞骨架的蛋白重排，穿过胞膜并在胞质中大量复制，最终导致宿主细胞受损与死亡［6］。但黏附作用与免疫反应之间的相互作用机制尚不清楚，目前认为与细胞分裂、细胞形态学变化、黏附作用、滑行运动等有关［7］。

2.1 黏附作用与相关蛋白

MP的黏附作用由一种特殊的顶端黏附细胞器调控，需要一系列复杂的肺炎支原体蛋白聚集于黏附细胞器上，包括主要表面蛋白P1(170 ku)、P30(30 ku)、P116、HWM1～HWM5以及蛋白质A、B、C。这些蛋白在结构和功能上相互协调，使肺炎支原体的主要表面黏附素在HMW蛋白的辅助下在细胞器的顶端呈现极端聚集。主要蛋白P1和P30可能直接参与黏附，而HMW蛋白和A、B、C蛋白为辅助蛋白，为某些功能所必须，不直接参与黏附。黏附素P1和P30被认为有明显的免疫原性［8］，如果缺乏这些蛋白，Pl则不能准确定位于顶端结构，其变为成熟蛋白的过程也将延缓。例如丢失HMW1的M6型突变株顶端变为卵圆形，P1只散布于MP细胞表面;在有HMW1等位基因表达的M6型突变重组体中P1聚集于一极，接近正常形态。在丢失HMW2的突变体中，HMWl、HMW3、P65等蛋白更新加速，P1定位异常;在有HMW2等位基因的重组转化株中，HMW2基因表达产物水平较低，只能介导血细胞吸附作用。HMW3突变株也出现类似现象［9］。Svenstrup等［10］证实这些黏附相关蛋白是按HMW1-HMW3-P1-P90-P65的顺序组装到MP附属结构上的，用免疫荧光显微镜可以检测到MP顶端结构中有3个独特的亚细胞蛋白定位点，即HMWl-HMW3、P1-P90-P40和P30-P65。以上表明，黏附蛋白复合体在MP附属结构的构建和稳定方面起到了重要作用。

黏附作用与炎症反应之间的相互作用已得到验证。具有黏附作用的肺炎支原体野生株产生前炎症因子，如TNF-α、IL-1β，但是高温致死的肺炎支原体或黏附作用缺陷的突变体明显比野生株产生较少的前炎症因子。肺炎支原体野生株以不依赖内毒素的方式产生TNF-α和IL-1β的前驱体，同时也产生半胱天冬酶-1和ATP流出物，促进IL-1β成熟，这表明肺炎支原体的黏附作用诱发炎症反应，并与肺炎支原体的致病性有关，但是目前黏附作用在炎症反应中的具体作用仍不清楚［11］。

2.2 信号转导与相关蛋白

目前普遍认为由P1蛋白介导的黏附作用是通过NF-κB通路进行信号传导的。现已发现3个与激活NF-κB相关的脂蛋白［11］，它们分别是MPN602、F0F1-ATPase的b亚族和二酯脂蛋白。F0F1-ATPase依赖于Toll-like受体(TLR1、TLR2和TLR6)激活NF-κB，将其他2种脂蛋白MPN161、MPN162分别指定为N-ALP1(NF-κB激活脂蛋白1)和N-ALP2(NF-κB激活脂蛋白2)，N-ALP1和N-ALP2通过TLR1和TLR2激活TLR信号，对N-ALP1和N-ALP2的功能分析［12］表明二者都是三酯脂蛋白。

在宿主细胞受到微生物感染的早期，具有模式识别功能的Toll-like受体在先天识别和炎症反应中起关键作用。在10个TLR家族中，TLR2、TLR4、TLR5和TLR9与不同细菌成分的识别有关。各种微生物的肽聚糖、酵母聚糖和脂蛋白由TLR2识别，脂多糖、细菌的鞭毛蛋白和DNA分别由TLR4、TLR5、和TLR9识别。TLR家族通过包括骨髓变异蛋白、IL-1R激活酶、TNF相关受体因子6和NF-κB诱导酶在内的IL-1R相关信号分子激活NF-κB通路。

3 与P1蛋白相关的实验室诊断法

肺炎支原体感染的快速确诊对临床和流行病研究都具有重要意义，但是目前常用的血清学方法只对提供回顾性诊断有帮助，且要求前后双份血清抗体滴度有显著提高，具有一定的局限性，易出现假阴性结果。利用肺炎支原体特异的P1蛋白基因作为诊断肺炎支原体感染的指标是目前极有价值且简便实用的方法。

3.1 利用P1蛋白进行的反向斑点杂交法

PCR具有敏感性高但假阳性率也较高的特点，在临床应用方面有一定局限性。樊慧珍等［13］利用肺炎支原体特异的P1基因设计引物，用PCR合成一段162 bp的长链DNA探针，通过反向斑点杂交法直接检测病原体DNA。合成的162 bp DNA探针，具有高度特异性，只和肺炎支原体杂交，与其他细菌、病毒、真菌等无交叉反应，而且长链DNA探针在检测基因组DNA方面的敏感性高于寡核苷酸探针。实验结果证明该方法应用于痰标本检测的阳性率显著高于培养法。该杂交方法的建立为临床微生物检测开辟了一条新途径，在肺炎支原体感染的早期诊断方面具有一定的应用价值，为临床早期诊断MP感染提供了可能。

3.2 lambda显示技术

lambda显示技术(lambda display technology)是从患者血清中提取一个全基因的肺炎支原体文库并在lambda噬菌体中进行表达的技术。这种方法可以辨别出携带B细胞抗原决定簇的重组噬菌体，从而可以分辨出与宿主抗体反应产生的细菌蛋白。在已知的肺炎支原体B细胞抗原中，黏附素P1和P30的免疫性得到最广泛的认可，并且它们的免疫优势表位已被人类免疫球蛋白识别。

通过描绘该文库识别出4种新的免疫原性的多肽，分别被MPN152、MPN426、MPN456和MPN500开放读码框架编码。这更加突出了lambda显示技术在抗原和表面决定簇识别方面的作用。多肽MPN500有一个区域属于黏附素P1蛋白家族，而lambda显示技术恰好能够识别蛋白MPN500的抗原区域。噬菌体克隆序列的MP-2.6短期多肽分析［5］表明来自同一个蛋白质家族之间的其他黏附素相应的序列变异性高，而MPN500包含一个能被肺炎支原体感染的患者抗体识别的免疫原性区，从而强调了该方法识别B细胞表位的有效性。细菌黏附作用中MPN500的功能，以及其在人类宿主中的免疫反应是有待进一步探究的问题。

综上所述，P1蛋白在MP的致病中起到了重要作用，因此越来越多的学者致力于P1蛋白的研究。目前该研究已发展到从分子水平探讨P1蛋白部分基因结构、致病机制以及在实验室诊断方面的应用。但是P1基因的功能尚不完全明了，P1黏附素的具体致病机制尚不清楚，P1蛋白的研究为MP感染的诊断与防治开辟了一个新的方向，但其实用性与安全性等仍值得探讨。

［1］ Rama Chaudhry，Nazima Nisar，Bhavna Hora，et al.Expression and Immunological Characterization of the Carboxy-Terminal Region of the P1 Adhesin Protein of Mycoplasma pneumonia［J］.Journal Of Clinical Microbiology，2005，43(1):321-325.

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