大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞的分离、纯化和鉴定

张雪梅，陈海龙，王朝晖，张 利，纪 军

肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar typeⅡ cells，ATⅡ）对维持肺泡的结构和功能具有重要意义，其功能包括增殖、合成和分泌肺表面活性物质、维持肺泡内外液体平衡及免疫调节作用。研究表明，急性肺损伤（acute lung injury，ALI）时肺组织的病理变化表现为肺泡上皮细胞的严重损伤。ATⅡ在肺损伤后肺泡上皮的修复与更新、表面活性物质的分泌、肺水转运过程中均有重要意义[1-2]。但由于ATⅡ具有特殊的生物学特性，尚未形成细胞株供研究用，且其分离、纯化、鉴定及原代培养的操作较为繁琐，细胞形态功能易发生变化，给研究工作带来不便。本实验是在总结和借鉴国内外学者经验的基础上，改良大鼠ATⅡ的分离、培养及鉴定方法。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠20只（大连医科大学动物实验中心，许可证号SCXK（辽）2002-0002），体质量180～220 g。

1.2 主要实验仪器 细胞培养箱（Heraeus德国）；研究级荧光倒置生物显微镜（Leica美国）；低温离心机（Sigma美国）。

1.3 主要实验试剂 达尔伯克必需基本培养基（DMEM，GIBCO公司）；胎牛血清（FBS GIBCO公司）；大鼠IgG（Sigma公司）；脱氧核糖核酸酶（DN-ase，Sigma公司）；胰蛋白酶（Difico公司）；SP-A多克隆抗体(Santa Cruz公司)；SABC试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.4 主要溶液 10%水合氯醛溶液。溶液Ⅰ：140 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，10 mmol/L HEPES，6 mmol/L葡萄糖，0.2 mmol/L EDTA，2.5 mmol/L磷酸氢钠缓冲液。溶液Ⅱ：溶液Ⅰ，2.0 mmol/L CaCl2，1.3 mmol/L MgS04[3]。用1 M NaOH调pH至7.4。溶液Ⅲ：溶液Ⅱ，0.25%胰蛋白酶，0.1%胶原酶。D-Hank液；0.25%胰蛋白酶，0.25%DNaseⅠ溶液。

2 方法

2.1 肺组织的消化及细胞混悬液的制备 大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 mL/kg，肝素400 U/kg。消毒，气管插管，腹主动脉放血活杀，剪开胸腔，去除胸腺。注射器吸取溶液Ⅱ（预温至37℃），于右心耳的位置轻轻进入朝肺动脉的方向注入，灌洗至全肺呈苍白色以去除血细胞，灌注量20 mL；经气管插管用溶液Ⅰ灌洗8次，再用溶液Ⅱ灌洗2次，至灌洗液清亮，去除巨噬细胞；溶液Ⅲ灌洗1次。快速取出肺移入超净操作台，溶液Ⅱ冲洗肺表面，经气管注入预温至37℃、0.25%胰酶消化液20 mL。37℃水浴消化25 min。去除肺门、大气道，在4 mL D-Hanks液中（含DNase 250 μg/mL），将肺剪碎至1 mm3大小。5 mL小牛血清灭活胰酶，移入无菌三角瓶，溶液Ⅱ补足至20 mL/肺，37 ℃水浴摇床130 r/min，5 min。细胞滤网过滤2次（150目，200目）。滤液移入50 mL无菌离心管以800 r/min、4℃离心8 min。细胞沉淀用10 mL DMEM重悬，计数[3-5]。

2.2 大鼠ATⅡ的纯化 IgG溶液倒入无菌培养皿内完全覆盖底部，22℃静置3 h，倒出IgG，PBS洗5次，DMEM洗2次，吸尽后另加入少量DMEM，4℃下静置24 h备用。将上述细胞悬液调整至浓度为106/mL，转移至用大鼠IgG包被的培养皿中，37℃、5%CO2培养箱孵育90 min，移出未黏附的细胞，4℃、800 r/min离心l0 min弃上清，无血清DMEM漂洗1次[6-7]。

2.3 ATⅡ的培养 DMEM重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为2×106/mL，转入六孔培养板，每孔加细胞悬液1 mL，37℃，5%CO2培养。24 h后移去未贴壁细胞，加入DMEM培养基继续培养，观察细胞生长状况。

2.4 ATⅡ活力的测定 细胞悬液和0.5%台盼蓝染液按l∶1体积比混合后滴加盖玻片，1 min后计数100个细胞，用活细胞占计数细胞的百分比表示细胞活力。

2.5 ATⅡ的鉴定 用免疫组化染色和透射电镜观察来鉴定ATⅡ。无菌载玻片置于培养皿底部，培养24 h后完成细胞爬片。丙酮固定5 min，按SABC免疫组化试剂盒操作说明完成免疫组化染色。SP-A抗体工作浓度为1∶200，阴性对照用PBS代替一抗。用苏木素复染，中性树脂封片后观察结果[8]。透射电镜鉴定ATⅡ：细胞悬液2 000 r/min离心10 min，弃上清，2.5%戊二醛固定过夜，PBS漂洗、锇酸后固定、梯度乙醇脱水、丙酮包埋，切成50～70 nm厚的切片，醋酸铀染色，柠檬酸铅复染，透射电镜下观察。

3 结果

3.1 ATⅡ光镜形态 分离纯化的ATⅡ细胞单层贴壁生长，在光镜下呈圆或椭圆形，直径10～20 μm，胞浆内含较多包含体，胞浆中央可见圆形细胞核，内见核仁（见图1）。

图1 倒置显微镜下的ATⅡ（200×）

3.2 SP-A免疫组化鉴定 免疫组化阳性信号为细胞浆内分布均匀的浅褐色颗粒（见图2）。

图2 ATⅡSP-A免疫组化鉴定（200×）

3.3 电镜下形态 电镜下可见ATⅡ细胞形状较规则，细胞表面有很多长短不一、粗细不等的微绒毛，胞核明显，胞浆内含有大小不一同心圆或平行排列的板层小体，少数细胞可以见到板层小体被分泌到细胞外（见图3）。

3.4 ATⅡ细胞活力和纯度 通过IgG免疫黏附纯化后的ATⅡ台盼蓝染色显示细胞活力为95%以上。

通过SP-A免疫组化染色纯化染色判定，纯化后ATⅡ的纯度可达92%。经上述初步鉴定，我们认为本实验培养的细胞为ATⅡ，且纯度、活力足够，可以用来进行下一步的实验研究。

图3 ATⅡ电子显微镜鉴定（8 000×）

4 讨论

肺泡上皮组织主要由Ⅰ型和Ⅱ型上皮细胞构成，ATⅡ约占60%，其覆盖面积只占肺泡总面积的4%，细胞为立方形，其特征性结构是胞质中含有大量的板层小体。ATⅡ是肺泡上皮细胞的祖细胞，有增殖能力和定向分化能力。体外培养后变成类似于肺泡Ⅰ型上皮细胞的扁平状，但这一过程是可逆的。该细胞基本不传代，并且分离、培养难度较大，不易获得数量较多同时还具有较高纯度的细胞悬液[9]。曾庆富等[10]报道，大鼠ATⅡ原代培养18～24 h，ATⅡ大量贴壁；36～48 h，细胞平展呈多边形，形成细胞单层，胞浆内有大量反差明显的细小颗粒，细胞核明显；第4 d细胞内颗粒有所减少；第6～7 d颗粒明显减少，细胞特征无法辨认。体外培养ATⅡ的生化特性变化也快，培养超过24～48 h ATⅡ的卵磷脂和磷酸甘油酯的含量和合成下降。培养24 h内，SP-A和SP-B mRNA减少。因此，ATⅡ在原代培养第24～72 h内处于最佳生长状态，此时适合用于体外实验研究。由于ATⅡ具有特殊的生物学特性，尚不能形成细胞株供研究用，且其分离、纯化、鉴定及原代培养的操作较为繁琐，细胞形态功能易发生变化，给研究工作带来诸多不便。

体内外实验证明，ATⅡ增生受角质化细胞生长因子的调控[11-12]，能分化为肺泡Ⅰ型细胞，在一定条件下也可逆转为ATⅡ。因此体外培养的ATⅡ细胞生物学特性仍是稳定的。

本实验发现，含20%FBS的DMEM培养液适宜ATⅡ细胞的生长。胰蛋白酶消化时间不宜过长。采用Dobbs等[3]年提出的IgG吸附纯化法可以得到纯度超过90%的ATⅡ细胞，并可将不需要的Ⅰ型上皮细胞及大多数成纤维细胞去除。

ATⅡ在光镜下胞浆内含较多包含体，细胞核明显。电子显微镜下可见到特异性的板层小体，这是鉴定ATⅡ细胞的最直接方法。ATⅡ细胞中SP-A含量最多，用SP-A免疫组化鉴定ATⅡ具有高度的特异性，同时也是一种简便的敏感方法。因此，电子显微镜与SP-A免疫组化结合鉴定ATⅡ可能是一种敏感、特异的鉴定方法。

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