95%乙醇在去除LASIK角膜板层刀片残留物质中的应用

梁 歌 刘海灵 高维平 李鹏飞 姜严明

2北京师范大学分析测试中心

3北京朝阳医院药事部

角膜板层刀是准分子激光原位角膜磨镶术（eximer laser in-situ keratomileusis，LASIK）常用的手术器械，其在经过生产、消毒及包装之后仍可能沾有部分残留物质，而这些残留物质是导致弥漫性板层角膜炎（diffuse lamellar keratitis，DLK）的重要因素之一〔1〕。手术前擦洗板层刀片有助于去除其上的残留物质，但因这些物质成分较为复杂，有些可能不溶于水，因此单纯用水冲洗并不能完全去除这些物质。Levinger〔2〕等报道用 100%（体积分数）的乙醇擦拭板层刀片可有效防止DLK的发生。我们参考Levinger的方法，用体积分数95%的乙醇擦拭板层刀片，再用无菌蒸馏水冲洗，然后应用液相色谱-高分辨飞行时间质谱法检测刀片上的残余物质，并对使用该法处理刀片的LASIK病例随访1年，观察术后角膜情况，以了解该方法是否能完全去除掉角膜板层刀上的残留物质，现将有关结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 液相色谱-高分辨飞行时间质谱分析

1.1.1 主要仪器与试剂：美国Agilent 1200液相色谱仪；德国布鲁克道尔顿公司Bruker micrOTOF-Q II高分辨质谱仪；乙腈（德国默克公司）；甲酸（北京化工厂）；95%乙醇（北京贞玉民生药业有限公司）。

1.1.2 分组处理：将同一批次购进的角膜板层刀片20把（一个包装，法国目利亚股份有限公司上海代表处，批号；1094813）分为实验组和对照组，均为10把。实验组用吸水海绵蘸取95%乙醇擦拭全刀身3次，再用无菌蒸馏水冲洗，对照组则不予上述处理。

1.1.3 样品前处理：取出刀片至于烧杯中，加入5 ml色谱纯乙腈冲洗刀片并浸泡0.5 h，超声10 min提取刀片上的残留物，直接上机测试，同时采用纯乙腈作为空白对照。

1.1.4 分析条件：（1）高效液相色谱：色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18（2.1 mm×150 mm，5 μm，Agilent Technologies，USA）； 流动相 A：0.1%甲酸水溶液；流动相 B：乙腈。 流速：0.25 ml/min；进样量：20 μl；柱温：25℃；洗脱条件：%A，初始 80%；20 min,20%;30 min,20%；紫外检测器波长：254 nm。（2）Q-TOF质谱：离子源：电喷雾电离（electrospray ionization,ESI），正离子模式；干燥气：氮气，流速 4.0 l/min，温度180℃；雾化气：氮气，61 kPa；毛细管电压：3 500 V；谱图扫描范围：m/z 50～3 000；仪器校正方式：每次实验前用甲酸钠校正液直接进样，正离子模式下校正仪器。

1.2 LASIK术后随访

我院眼科准分子治疗中心自2010年12月20日起至2012年12月1日为止，共随访了使用95%乙醇处理刀片的LASIK术后病例778人（1 552只眼），女性 442人，男性336人，年龄18～44岁；术前诊断均为近视，等效球镜度数范围-1.50～-10.25 D。所有患者经术前检查符合手术适应症，术前角膜板层刀以95%乙醇擦拭全刀身3次，再用蒸馏水充分冲洗，术中无不良情况发生，术后给予患者0.5%左氧氟沙星眼液，0.1%氟米龙眼液（日本参天公司）点眼，佩戴防护眼镜。术后第1天复查内容为视力，电脑验光，角膜地形图，裂隙灯下观察角膜愈合情况，术后1周，1个月，3个月，6个月，1年来院复查，复查内容为视力，电脑验光，裂隙灯下观察角膜愈合情况。

2 结果

2.1 角膜板层刀片检测结果

经过95%乙醇处理过的手术刀片（实验组）未检出其他化合物，总离子流图标记的峰1和峰2所对应的质谱信号都很弱，与溶剂的背景噪音相当（图1）。对照组刀片峰总离子流图（图2A）峰1和峰2信号强度时远远大于实验组的峰1和峰2信号强度（图1A），通过与用乙醇处理过的刀片的质谱结果进行对比发现对照组板层刀上残留的离子可能为m/z=282.280 1 和 m/z=754.581 5（图 2）。

图1 经95%乙醇（体积分数）处理的角膜板层刀提取液的总离子流图及相对应的质谱图。1A.总离子流图；1B.峰1和峰2对应的质谱图（方法：液相色谱-高分辨飞行时间质谱分析）

图2 未经乙醇处理的角膜板层刀提取液总离子流图及相对应的质谱图。2A.总离子流图；2B.峰1和峰2对应的质谱图（方法：液相色谱-高分辨飞行时间质谱分析）

2.2 随访病例角膜情况

至2012年底，随访1年以上者778例，所有患者术后角膜情况良好，无不良反应发生。

3 讨论

弥漫性板层角膜炎（DLK）是LASIK术后重要的并发症，由 Smith 和 Maloney〔3〕在 1998 年首先报道，Linebarger根据其临床表现将其分为4期〔4〕。 它的发生可能与板层刀片残留物质等有关〔5-9〕。角膜板层刀为一次性使用器械，其在加工、消毒及包装过程中仍有可能受到物质污染。我科于2010年10月连续2次爆发LASIK术后DLK，分析原因，并通过液相色谱质谱分析的方法（图2），确认了角膜板层刀上残留的化合物为致病原因〔10〕。但因样本量较少，我们仅得到这些化合物的分子式及分子量，即C18H36NO（相对分子质量 282.280 1）和 C51H72N5（相对分子质量754.581 5），未能确认其相对应的具体物质名称。这些物质成分较复杂，不一定均具有水溶性，因此仅用无菌蒸馏水不能彻底清除，我们曾经手术前在无菌蒸馏水中反复运行角膜板层刀，在准分子激光切削之后，又用无菌蒸馏水反复在角膜瓣下及角膜基质面上冲洗，仍不能防止DLK的发生。在对同一批次刀片做质谱分析时，未经过乙醇处理的手术刀提取液总离子流图与经过酒精处理的取液总离子流图有明显差异。我们参考Levinger的方法，角膜板层刀以95%（体积分数）的酒精擦拭，再用无菌蒸馏水冲洗后，对其进行液相色谱质谱用分析时未再发现前述化合物（图1）。说明这种方法能很大程度上去除掉角膜板层刀上的残留物质。另一方面我们可以认为这些化合物水溶性较差，这为我们下一步查实其相对应的具体物质提供了一个范围。因DLK有迟发的报道〔11-12〕，所以我们对手术后的778例病人进行了为期1年以上的随访，无1例发生不良反应。这些病人所用的角膜板层刀，均经过上述方法处理。

因此，我们认为Levinger的方法在去除角膜板层刀残留物质方面是安全有效的，可有效地防止DLK的发生，该方法条件简单，操作方便，适用于临床。

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[3]Smith RJ，Maloney RK.Diffuse lamellarkeratitis.A new syndrome in lamellar refractive surgery[J].Ophthalmology，1998，105（9）：1721-1726.

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[10]梁歌，李鹏飞，孟晓丽，等.角膜板层刀残留物质致弥漫性板层角膜炎的因素分析 [J].中华眼科杂志，2013，49（4）：357-359.

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