利用二维色谱与质谱联用技术检测大肠癌蛋白质谱差异表达

张照红,姚嵩梅,何成彦,张耀中

(吉林大学中日联谊医院,吉林长春 130033）

大肠癌是当前严重危害人类健康的恶性肿瘤。全世界每年大约有100万大肠癌新发例,49.2万人死于大肠癌[1]。近年来,大肠癌的诊断及综合治疗水平取得了很大的进展,但其发病率和死亡率并未发生根本性的变化,因此大肠癌复杂的发病机制需要继续不断的研究。肿瘤蛋白质组学是近年来发展起来的新兴科学,随着技术的不同完善,在临床研究中越受青睐,应用越来越广。本研究应用蛋白质组学技术中的重要方法二维色谱与质谱联用技术探讨Dukes B期大肠癌与癌旁正常组织的蛋白质的差异性,为进一步研究大肠癌的病因、机制、转移及治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 组织标本

收集吉林大学第三医院18例手术治疗的大肠癌患者的肿瘤组织标本均经病理学检查证实为Dukes B期及各患者距离肿瘤组织边缘10 cm以外的上端癌旁组织标本,术前均经患者同意。患者术前未接受任何治疗,年龄49-78岁,中位年龄57岁,其中男13人,女5人。将所获得的新鲜标本离体后用生理盐水冲洗干净后,放入液氮冷冻,-80℃保存。

1.2 主要试剂

Bio-Rad公司的碘代乙酰胺(IAA）、尿素(Urea）、硫脲(Thiourea）、三羟甲基氨基甲烷(Tris base）、3-[(3-胆酰胺丙基）-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS）、碳酸氢氨、苯甲基磺酰氟(PMSF）、Sigma公司的DNA酶和RNA酶、超纯水、安捷伦公司的1200纳升级液相色谱分析仪和赛默飞世尔公司的LTQXL离子肼质谱仪。

1.3 实验方法

(1）组织总蛋白质的提取及蛋白浓度分析:对组织标本进行研磨,裂解,低温匀浆,离心,将蛋白上清液吸出备用,使用核酸蛋白分析仪检测后利用标准曲线分析计算蛋白浓度,分装,-80℃保存备用。

(2）组织蛋白水解多肽混合物的制备:将提取保存的组织蛋白室温融化,用25 mM NH4HCO3稀释,使尿素浓度低于2M,加入1 M的DTT,充分混匀,使其终浓度为20mM,56℃下还原1 h后降至室温加入1M的碘乙酰胺混匀使其终浓度为50 mM,常温下避光反应30 min,按1∶50加入测序级胰酶37℃酶切过夜,酶切后样品真空抽干后-80℃保存备用。

(3）二维色谱与质谱联用分析与数据库检索:将所有样品用缓冲液A溶解,,各取50 μ g样本上样经反相色谱洗脱的多肽应用LTQ XL质谱仪检测,核质比检测范围为400-2 000 amu,应用数据依赖方式进行次二级质谱扫描。

(4）强度在10个单位以上、有10个以上离子信号的谱图用SEQUEST算法和Bioworks 3.3.1 SP1软件包进行数据库检索,鉴定出相关多肽和蛋白。SEQUEST检索后筛选参数如下:1、Rsp= 1;2、在假阳性率为1%时,DeltaCn≥0.19,Xcorr值在单电荷时为2.2,双电荷时为2.5,三电荷为2.9。

2 结果

2.1 肿瘤组织总蛋白酶解混合物的二维色谱与质谱联用分析结果

肿瘤组织制备的蛋白水解多肽混合物进行二维液相色谱与质谱联用分析,得到肿瘤组织酶解混合物的多肽质谱数据,总共鉴定出860个蛋白质。

2.2 癌旁组织总蛋白的二维色谱与质谱联用分析结果

癌旁组织制备的蛋白水解多肽混合物进行二维液相色谱与质谱联用分析,得到癌旁组织酶解混合物的多肽质谱数据,总共鉴定出549个蛋白质。

2.3 肿瘤组织与癌旁组织差异蛋白质的质谱分析

应用每个蛋白质的谱图数来评价其丰度。对于在不同样本中丰度发生变化的蛋白,其谱图数变化必须满足一下原则:1、两个样本中谱图数的比值大于等于 1;2、两个样本中谱图数的差值大于等于72(平均每次实验差值为24）。为评价上述方法用于鉴定蛋白丰度变化的假阳性率,每个样本进行了3次实验,然后将结果相互比较分析,相应假阳性率为2.13%。将肿瘤组织与癌旁组织的蛋白质组分析的结果进行对比共得到23个蛋白在肿瘤组织中表达下调,见表1。

表1 二维色谱与质谱鉴定的有显著差异的肿瘤组织下调蛋白

3 讨论

细丝蛋白A(Filamin-A,FLNa）

FLNa属于肌动性结合蛋白(actin binding protein,ABP）,参与细胞骨架的形成,与细胞的增殖、粘附、迁徙、信号转导及肿瘤发生等密切相关[2]。FLNa基因结构高度保守,表达广泛,对哺乳动物的生长发育具有重要作用。FLNa包含A、B、C 3个亚型,每个亚型相对分子质量为280×103,长度约为80 nm。FLN a分子包含N末端的肌动蛋白结合结构域,4-24个串联的重复序列形成的棒状结构域及由大约30个氨基酸残基形成的2个铰链区域。每个重复序列均由96个氨基酸形成多个反向平行的免疫球蛋白样的β片层结构,其中第9-15个重复序列含有与肌动蛋白高亲和性结合所必需的结构域,第16-24个重复序列含有一个与配体相结合的位点,第24个重复序列末端相连形成与其功能有关的“V”同源二聚体结构,因而具有良好的韧性,并且机械性信号杆部的重复序列和铰链区域而进行传递[3]。FLNa主要分布在细胞质,具有多种功能,N末端的肌动蛋白结合结构域能与ABP结合,可交联肌动蛋白形成稳固的细胞骨架,与细胞运动有关;多重β片层结构为蛋白质-蛋白质相互作用提供了平台,能够与多种具有重要功能的蛋白质相互作用;其与组织因子相互作用,促进血管重塑和肿瘤细胞的转移[4];因此,FLNa分子作为一种重要的信号转导支架蛋白参与细胞增殖、黏附、侵袭等多种行为[5]。此外,FLNa还与其他ABP一起影响多种受体在细胞内的表达,干预多条与肿瘤形成有关的信号转导通路,在肿瘤的发生发展中至关重要[6]。

本研究用免疫组织化学和Western blot技术对直肠癌组织及正常直肠组织进行定位及定量检测,结果显示FLN a蛋白、mRNA在直肠癌组织中的表达水平均显著低于正常直肠组织,取得了一致结果。Bedolla等使用免疫组织化学法检测了不同进展阶段的前列腺癌组织标本FLNa蛋白表达情况,发现与良性前列腺、前列腺上皮内瘤和原位癌的FLNa蛋白表达相比,转移性前列腺癌FLNa蛋白细胞质内FLNa表达明显减少,而细胞核内表达明显增多,并认为这可能与癌细胞恶性程度增加有关。这些结果还难以解释,可能是由于FLNa对不同部位、不同病理类型的瘤细胞存在着不同的作用,其机制还有待于进一步探讨。

本实验癌组织的FLNa蛋白表达低于正常组,说明FLNa蛋白可抑制结直肠腺癌的发生,在病理状态下呈低表达,同时FLNa蛋白的表达水平与肿瘤的侵袭力呈负相关,对结直肠腺癌的侵袭转移具有阻遏作用,有望成为结直肠腺癌预后判断的新指标。

Transgelin(胶转蛋白）

Transgelin又称SM-22 alpha是一种主要在脊椎动物平滑肌中表达的保守蛋白[7-8],分子量为22 kD,1987年LESS-MILLER在鸡胃中首先发现。人类Transgelin基因定位于染色体11q 23.2上,其cDNA含有1 214 bp和200个氨基酸序列的阅读框[11]。胶转蛋白是一种肌动蛋白压力纤维素相关的蛋白质[13],与凝胶剂起反应并能稳定体外的肌动蛋白凝胶剂。它还与平滑肌中的激动蛋白丝有相关性[14]。

很多研究已经证明胶转蛋白可能存在抑制肿瘤的作用。细胞骨架肌动蛋白纤维的分解是癌症细胞表型发展的一个基本证据。一些蛋白质结合肌动蛋白后形成交联,增加蛋白丝的硬性,防止其出现去极化,并使蛋白丝凝结为应力纤维。正如RNA和DNA病毒的永生状态和转录一样,含TGB-β的细胞孵化的延长减少了应力纤维的形成,阻碍了细胞的移动,并抑制了胶转蛋白的表达[15]。研究报道用差异筛选技术分离正常膀胱组织和膀胱癌组织中差异表达基因,发现Transgelin基因在正常膀胱组织中高表达,在膀胱癌中表达下调,可能反映了肿瘤细胞在细胞黏附、细胞间相互作用、迁移及运动等诸多过程中的异常,可能与癌细胞的侵袭和转移密切相关。

应用比较蛋白质组学分析发现,大肠癌标本与正常大肠黏膜比较Transgelin的表达明显下调,其中Transgelin的DNA甲基化起重要作用,同时Transgelin表达量低的患者与表达量高的患者比较预后较差[16]。Shiel DS[17]的研究发现在人乳腺癌和结肠癌细胞系及肿瘤标本中Transgelin基因均降调节,这与本实验结果相一致。这些研究证实Transgelin基因的表达缺失有可能是肿瘤进展过程中的早期事件。Transgelin基因可能是一种新的抑癌基因,可能会对这些常见癌症介入治疗的发展提供一定的目标。但亦有研究表明Transgelin蛋白在胃癌和食管鳞状细胞癌组织中高表达。因此,Transgelin基因在恶性肿瘤发生、发展中的作用还有待进一步研究。

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