人前列腺癌细胞特异性结合短肽在人体组织的分布

胡金秋,李 伟,张丽红,张国荣,刘志晶,董欣洁,张玉辉,李一雷

(1.长春医学高等专科学校病理教研室,吉林长春 130031;2.吉林大学病理生物学教育部重点实验室,吉林长春 130021）

前列腺癌(Carcinoma of Prostate,PC）是男性泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤,在欧美等西方国家仅次于肺癌是男性第二大癌症[1],在我国的发病率位居男性泌尿生殖系统恶性肿瘤的第三位。远处转移是前列腺癌患者最主要的死亡原因。因此,从前列腺癌的侵袭、转移方面作为切入点采用导向治疗的方法着手研究前列腺癌的治疗是未来人类战胜前列腺癌的一个可能突破点。在前期研究中,利用噬菌体随机七肽库筛选得到一组与人前列腺癌细胞PC-3M特异性结合的前列腺癌转移相关短肽[2-5],选取与共有序列最接近的特异性短肽,研究该结合短肽的配体蛋白在人体正常组织中的分布,为探索其在临床抗前列腺癌导向治疗中的应用提供形态学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 石蜡标本收集 收集2006年-2008年吉林大学白求恩医学院尸检及活检标本:尸检石蜡标本12例,组织块53块,包括脏器16种;前列腺组织活检石蜡标本11例。

1.1.2 主要试剂 PC-3M细胞来源于美国细胞库(American Type Cuhure Collection,ATCC）;抗M13小鼠单隆抗体购自瑞典Amersham公司,IMDM培养液购自GIBCO公司;SP免疫组化试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司;胰蛋白酶购自杰华科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PC-3M细胞培养及爬片 将PC-3M细胞用含10%胎牛血清的IMDM培养液中传代培养,细胞生长至80%融合时以每孔2×104个细胞加入24孔板,每孔加500 μ l细胞悬液。继续培养6小时后分别加入特异性结合短肽各1×1011pfu共培养,分别以加入空载体和IMDM培养基作为阴性对照。24小时后,细胞融合达80%,4%多聚甲醛固定。

1.2.2 扩增特异性结合短肽并测定滴度 用待扩增短肽感染大肠杆菌ER2738并扩增,用PEG/NaCl在4℃沉淀噬菌体。用10倍系列稀释的噬菌体接种好ER2738的LB/IPTG/Xgal平板,检查计数有-102个噬菌斑的平板上的噬菌斑数,再用此数目乘以稀释因子即得到每10μ l噬菌体的空斑形成单位(pfu）滴度。

1.2.3 免疫组织化学方法进行检测 特异性短肽是表达在M-13噬菌体表面的,所以选用抗M-13噬菌体抗体作为检测短肽与细胞结合的抗体。用PC-3M细胞作为阳性对照,用PBS和空载体分别取代特异性短肽,用PBS取代抗M-13噬菌体抗体做阴性对照,对人体各组织标本进行免疫组织化学染色。前列腺癌转移相关蛋白结合物是人前列腺癌PC-3M细胞膜蛋白的结合物,所以该短肽与待检测组织细胞的结合均以细胞膜上出现黄色颗粒为判定阳性的标准,基本不着色定为阴性(-）,淡黄色定为弱阳性(+）、黄色定为阳性(++）、棕黄色定为强阳性(+++）。本文结果所统计的阳性率是以+-+++为阳性计算。

2 结果

2.1 前列腺癌转移相关蛋白结合物的配体蛋白在上皮组织的分布

2.1.1 前列腺癌转移相关蛋白结合物的配体蛋白在腺上皮的分布 免疫组织化学半定量分析表明,前列腺癌侵袭相关蛋白结合物在胰腺的内分泌部即胰岛有配体蛋白能与之结合,12例标本中阴性有6例,弱阳性为2例,阳性为4例,其阳性率为50%。在胃底腺壁细胞上有配体蛋白与短肽结合,10例标本中阴性为4例,表达为弱阳性有2例,阳性有4例,其阳性率为60%。在肾上腺等其他腺体中未见有配体蛋白与之结合(表1,图1、2）。

表1 前列腺癌转移相关蛋白结合物的配体蛋白在腺上皮的分布

2.1.2 前列腺癌转移相关蛋白结合物的配体蛋白在被覆上皮的分布 免疫组织化学半定量分析表明,前列腺癌侵袭相关蛋白结合物在各种被覆上皮中未见有配体蛋白与之结合(表2）。

2.2 前列腺癌转移相关蛋白结合物的配体蛋白在结缔组织和神经组织的分布

免疫组织化学半定量分析表明,前列腺癌侵袭相关蛋白结合物在结缔组织和神经组织中未见有配体蛋白与之结合(表3）。

2.3 前列腺癌转移相关蛋白结合物的配体蛋白在肌组织的分布

免疫组织化学半定量分析表明,前列腺癌侵袭相关蛋白结合物在肌组织中未见有配体蛋白与之结合(表4）。

图1 前列腺癌转移相关蛋白结合物的配体蛋白在胰腺上的分布

图2 前列腺癌转移相关蛋白结合物的配体蛋白在胃底腺上的分布

表2 前列腺癌转移相关蛋白结合物的配体蛋白在被覆上皮的分布

表3 前列腺癌转移相关蛋白结合物的配体蛋白在结缔组织和神经组织的分布

表4 前列腺癌转移相关蛋白结合物的配体蛋白在肌组织的分布

2.4 前列腺癌转移相关蛋白结合物的配体蛋白在前列腺增生的表达情况

免疫组织化学半定量分析表明,前列腺癌侵袭相关蛋白结合物在前列腺增生时未见有配体蛋白与之结合(表5）。

综上结果显示,检测了人体脑、心、肝、肾、喉、气管 、肺 、脾 、垂体 、肾上腺 、甲状腺 、胸腺 、小肠 、胃 、胰腺、卵巢共16种器官,人前列腺癌细胞转移相关蛋白的特异性结合短肽与被覆上皮、肌组织、神经组织、结缔组织无结合;与大多数腺上皮无结合;与人胃底腺壁细胞有亲和性,配体蛋白表达的阳性率为60%;与胰岛细胞有亲和性,配体蛋白表达的阳性率为50%;在良性前列腺增生时无表达。

表5 前列腺癌转移相关蛋白结合物的配体蛋白在前列腺增生的结合情况

3 讨论

前列腺癌已经成为男性泌尿生殖系统最常见的恶性肿瘤之一。虽然目前对前列腺癌有多种治疗手段,如内分泌治疗、放疗、化疗和手术治疗。但无论哪种治疗方法对于发生了雄激素抵抗的患者都不能达到理想的治疗要求[6],因而探讨前列腺癌的治疗方法是临床上迫切需要的。

前列腺癌蛋白质组学在国际上正在进行,如前列腺肿瘤标记物的寻找、前列腺癌的诊断、干预机制的研究等[7-9],努力寻找能够特异性杀伤肿瘤细胞的抗肿瘤药物是许多致力于肿瘤研究的学者所研究的热点项目[10]。抗肿瘤导向治疗的问世更需要高效特异性载体,以实现抗肿瘤治疗的高效能性和低损伤性。

结合前期进行的前列腺癌特异性结合短肽方面系列研究[2-5],本实验观察序列为CGWTPVI的特异性结合短肽的配体蛋白在人体正常组织中的分布情况,从而为该短肽在抗前列腺癌导向治疗中的应用提供形态学依据。掌握该短肽的配体蛋白在人体组织器官中的分布情况将使短肽有可能成为导向治疗的更高效载体,使药物在前列腺癌局部达到高浓度发挥作用,而不与人体正常组织细胞结合从而减少药物的副作用。本实验还同时检测该配体蛋白在前列腺增生时的表达情况,目的在于观察在前列腺良性病变和恶性病变时蛋白表达的差异,以便进一步分析此种蛋白表达差异对细胞生物学行为的影响,探讨肿瘤转移的可能机制。

进而,在前期系列研究基础上,还可以通过钓取人前列腺癌PC-3M细胞膜上与特异性短肽相结合的配体,对其详细信息和功能进行分析,进一步研究蛋白质间相互作用。或者进一步检测该特异性短肽在各型前列腺癌和其它肿瘤细胞上是否有配体蛋白,探讨该短肽是特异性存在于高转移性前列腺癌细胞,还是多种高转移性肿瘤细胞所共有,从而有可能发现一种全新的肿瘤转移相关蛋白。进一步探讨与前列腺癌细胞转移有关的细胞内信号转导通路,为研究前列腺癌或者其他肿瘤的侵袭转移机制提供线索。

总之,本实验检测了前列腺癌转移相关结合短肽的配体蛋白在人体组织、器官中的分布情况,并检测了短肽在前列腺增生时配体蛋白表达情况,掌握了短肽的特异性,这为进一步研究前列腺癌细胞侵袭转移的机制提供了研究线索,为该短肽在前列腺癌的抗肿瘤导向治疗中的应用提供形态学依据。该短肽可与前列腺癌细胞表面特异性蛋白结合,而与大部分人体正常组织无结合,具有良好的特异性,证明该短肽具有临床应用的潜能,为针对前列腺癌的抗肿瘤导向治疗中药物载体的设计提供了基础实验数据。

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[4]李 群,李一雷,李贵荣,等.转移潜能不同的人前列腺癌细胞系差异膜蛋白质组学的分析[J].中华肿瘤防治杂志,2008,15(2）:118.

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