米曲霉菌种选育的研究进展

李 晶 马贵民

（黑龙江生物科技职业学院食品生物系，哈尔滨 150025）

米曲霉菌种选育的研究进展

李 晶*马贵民

（黑龙江生物科技职业学院食品生物系，哈尔滨 150025）

介绍了诱变育种、原生质体融合及基因工程技术在米曲霉茵种选育中的应用及研究进展。

米曲霉；诱变育种；原生质体融合

米曲霉（Aspergillus oryzae）是发酵工业常用的生产菌种，分类上归属于半知菌亚门，是曲霉属真菌中的一个常见种，该菌株酶系广泛，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、果胶酶、纤维素酶、植酸酶等，可被广泛应用于酿造酒、调味品和饲料生产等发酵工业，并已被安全地应用了1 000多年。然而在发酵生产过程中，由于长期的移种和保藏，菌种会出现退化，导致米曲霉酶活性和代谢能力降低，严重影响产品的产量和品质，因此，菌种选育工作就显得十分重要了。近年来国内外育种工作者们利用不同的育种方法对米曲霉菌种进行定向改良，优化菌种资源，并已取得了显著的成绩。

1 米曲霉诱变育种的研究

诱变育种是当前菌种选育的一种主要方法，在生产实践中使用的十分普遍。诱变育种和其他育种方法相比，具有明显的优势，操作速度快、收益大、方法简单，但是诱变育种缺乏定向性，因此诱变突变必须与大规模的筛选工作相配合才能收到良好的效果。目前，诱变育种仍然是米曲霉菌种选育的主要方法。

米曲霉的诱变育种一般采用对细胞或原生质体进行物理及化学诱变，来筛选出高产各种酶类的菌株，我国开展这项育种工作已有50多年的时间了，许多研究机构在这方面都做了大量的工作，并取得了可喜的成绩。目前国内大部分酿造厂一直沿用至今的沪酿3.042米曲霉是林祖申先生在20世纪60年代用紫外线诱变和高蛋白质驯养选育出的，该菌株具有生长快、孢子多，制曲管理容易等优点，颇受生产单位欢迎。为了进一步提高原料利用率，降低生产成本，林祖申先生以泸酿3.042米曲霉为出发菌株，采用快中子、钴60γ-射线、紫外线、甲基磺酸乙酯（EMS）、氯化锂等交替诱变育种，筛选出了UE336-2新菌种，并测得中性蛋白酶活力比对照菌提高1倍以上，将其应用于酱油生产，原料全氮利用率可提高7.3%。

在近十年时间里，米曲霉的诱变育种工作也取得了显著成绩。周其洋以米曲霉1-7.3为出发菌株,经过紫外诱变、初筛得到生长速度快、孢子颜色和菌落形态发生变化的菌株125株，再经过制曲复筛进一步得到了一株综合酶系优良的目标菌株80 110，该菌株在多种酶系的活力上都有明显的提高。邵伟等以沪酿3.042为出发菌株，经对其孢子进行紫外线和硫酸二乙酯复合诱变，经温度选择培养，得到一株变异菌株A11。该菌株在45℃条件下仍能生长发育，且蛋白酶活性高，有较好的遗传稳定性。郭继平等以从自然发酵黄豆酱中筛选的5株野生米曲霉为供试菌株，筛选出米曲霉K61作为诱变出发菌株，采用紫外诱变对米曲霉K61菌株进行改造，筛选出一株蛋白酶活力高且遗传性能稳定的突变株Y29。该菌株应用于黄豆酱的生产中，蛋白酶活力明显高于米曲霉沪酿3.042菌株，且米曲霉Y29的酱香更浓郁一些，氨基酸态氮含量也高于米曲霉沪酿3.042菌株。马琼以米曲霉作为原始菌株，经硫酸二乙酯（DES）、紫外线照射复合诱变，得到一株高产纤维素酶的突变菌株Ⅱ5，其纤维素酶活力高达100.23 U/100mL，为出发菌株的1.39倍。

随着研究方法的不断深入，新的诱变育种方法也在得到不断地尝试。邓静等以去壁米曲霉孢子为诱变对象，采用Licl2微波、DES2超声波复合诱变，最终选出1株高产酸性蛋白酶的菌株C2，其产酸性蛋白酶活力是原始菌株的135.0%。王华等以米曲霉3.042一级菌种为出发菌株，采用不同压力梯度处理米曲霉孢子悬液，筛选获得了一株可稳定遗传的HP300a理想变异菌株，这是高压诱变法在米曲霉菌种选育中的首次尝试，他不仅为高压诱变筛选米曲霉优良菌种提供了一定的理论依据，而且也为运用高压技术诱变菌种这一新的领域提供了理论依据。离子注入诱变育种技术是近些年发展起来的物理诱变技术，作为一项微生物新型诱变方法已经得到了广泛的应用并且取得了相当的成就。曹小红等选用N＋离子注入的方法对3.042米曲霉进行诱变育种，筛选得到蛋白酶活力有所提高的突变菌种TK-7，该菌株在三角瓶曲的蛋白酶活和原菌株相比提高了36%，诱变试验效果显著。

国外科研人员对米曲霉的诱变育种研究的也很多，如井口氏对米曲霉生产菌种曾进行过Χ线照射诱变，得到蛋白酶活力比原出发菌株高2倍的X-816菌株，那须野氏再次诱变，把X-816的蛋白酶活提高到6倍，所得到的变异株与原出发菌株的酶系统没有改变。Biesebeke等对米曲霉进行诱变育种，结果表明，突变后菌株产淀粉酶活力提高50%，葡萄糖化酶活力提高近100%，蛋白酶活力提高90%。

2 原生质体融合技术在米曲霉菌种选育中的应用

自1974年匈牙利的FerenczyL等采用离心力诱导的方法，首次报道了白地霉营养缺陷型突变株的原生质体融合方法以后，原生质体融合技术就成为了微生物育种的一项新技术。米曲霉是食品酿造工业中的重要微生物，利用原生质体融合技术选育优良米曲霉菌株一直是国内外育种工作者研究的热点问题。

我国米曲霉原生质体融合技术研究开始于20世纪80年代，邢来君等人首先对米曲霉原生质体的制备和再生条件进行了研究，随后对米曲霉进行了原生质体的营养互补融合，成功获得了融合子，融合频率为0.24%～0.47%。20世纪90年代，辛明秀等采用混合酶液处理米曲霉3.042营养缺陷型菌丝获得原生质体，以PEG为融合剂进行融合处理，成功地获得米曲霉原生质体的营养互补融合。早期的米曲霉原生质体融合技术均采用的是营养缺陷型亲本，但是营养缺陷型亲本菌株遗传标记的诱变筛选既费时又费力，而且会带来一些不良突变。近10年里，育种工作者们在米曲霉的融合方法上做了大量的研究，普遍采用双亲灭活原生质体融合的方法，弥补了不足，并取得了可喜的成绩。唐洁等对米曲霉CICC2339和米曲霉AS3.951菌株的原生质体分别进行了微波和紫外灭活，然后在融合剂的作用下对灭活双亲进行融合，筛选出3株生长速度快且蛋白酶活力高的融合株。王燕对米曲霉（AS3.951） GIM3.13和CICC2339的原生质体分别进行热灭活及紫外灭活，然后对灭活双亲用PEG作融合剂进行原生质体融合，筛选出来比亲本产酶高的融合株。唐洁等人还采用了电诱导融合的方法，成功获得了融合菌株。日本曾在1983年和1984年分别报道了利用原生质体融合技术改良米曲霉生长特性及蛋白酶活性而进行酱油菌种的育种工作。

3 基因工程技术在米曲霉菌种选育中的应用

随着基因技术的飞速发展，人们开始利用基因工程技术进行菌株改造，以获得更符合生产需要的优异菌株。陆健等运用PCR介导的定点突变对米曲霉来源的木聚糖酶在毕赤酵母中的重组表达进行了研究，获得1个表达量远远高于亲本的突变株I156A。X.F.Zheng等人通过构建一株由反义RNA表达而低产丝氨酸羧肽酶的米曲霉突变株，实现了高产多种蛋白酶的愿望。在酱油生产过程中，羧肽酶和碱性蛋白酶与氨基酸的生成直接相关，目前这两种酶的基因已成功克隆并转化，在新构建的基因工程菌株中碱性蛋白酶的活力可提高5倍，羧肽酶的活力可大幅度提高13倍。另外酱油制造中和压榨性有关的多聚半乳糖醛酸酶、葡聚糖酶、纤维素酶和果胶酶等的基因均已被克隆，当用高纤维素酶活力的转基因米曲霉生产酱油时，可使酱油的产率明显提高。

日本研究人员在2005年成功破译了米曲霉的基因组，在基因组已被破译的微生物中，米曲霉的碱基对数目是最多的。米曲霉含有大量与蛋白质和脂肪分解酶相关的基因，能够把蛋白质分解成让酿造食品更具美味的氨基酸。研究人员认为，基因组所包含的信息可以用来寻找最适合米曲霉发酵的条件，这将有助于提高食品酿造业的生产效率和产品质量，为发酵食品的生产提供更为有利的依据。

4 展望

目前米曲霉菌种选育已取得了显著的成绩，许多优良的菌种被选育出来并用于国内外的工业化生产。传统的诱变育种和原生质体融合技术在米曲霉菌种选育上已经得到了广泛的应用，但还存在一些问题，如随意性较大，缺少定向性。随着对米曲霉分子生物学研究的不断深入，以基因工程技术为主的多样化育种方式将会应用到米曲霉的选育中，并为高品质产品的开发提供一个崭新的途径。

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The research progress ofaspergillus oryzae in strain breeding

LI Jing*MAGui-min
（Department offood biotechnology，Heilongjiangvocational college ofbiologyscience and technology，Harbin 150025，China）

The application and research progress of mutation breeding,protoplast fusion and gene engineering technologies on aspergillus oryzae in strain breedingwere reviewed.

aspergillus oryzae；mutation breeding；protoplast fusion

TS261.+2

A

1673-6004（2011）04-00011-03

* 李晶，女，1978年出生，2004年毕业于齐齐哈尔大学遗传学专业，硕士，讲师。

2011-11-21