钙蛋白酶相关疾病研究进展*

范丽萍 杨明

(1.广州体育学院,广东 广州 510075;2.乐山市公安局,四川 乐山 614000)

钙蛋白酶系统主要由钙蛋白酶(Calpain)和其内源性抑制剂蛋白(Calpastatin,CAST)组成,钙蛋白酶是体内除了钙调神经磷酸酶外另一重要的Ca2+依赖性蛋白酶。钙蛋白酶属于半胱氨酸蛋白激酶,不仅参与蛋白质水解,还参与肌肉生长与分化、神经发育、细胞周期调控与凋亡、葡萄糖转运、细胞信号转导等正常的生理过程。近年来研究发现钙蛋白酶还与肌肉萎缩,缺血再灌注损伤、2型糖尿病、风湿性关节炎以及阿尔茨海默病等疾病的发生有关,随着研究的深入,钙蛋白酶成为这些疾病靶向用药的研究热点。

1 钙蛋白酶概述

到目前为止,哺乳动物中已发现15种钙蛋白酶,相关编码基因共 15个,其中 13个编码 15种大亚基,2个(Capn4,Capn14)编码2种小亚基[1]。钙蛋白酶家族成员互为同工酶,普遍存在于绝大多数动物细胞内,有的分布广泛,如钙蛋白酶I(μ-calpain,calpain1)和钙蛋白酶 II(m—calpain,calpain2);有的则表现出很强的组织特异性,如钙蛋白酶IIIa(calpain3a)主要分布于骨骼肌,而calpain8a,calpain8b主要分布于胃组织。

钙蛋白酶由 1个大亚基(80 k D)和 1个小亚基(30 kD)组成异二聚体。大亚基有 4个结构域(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ):结构域Ⅰ位于N一末端,与Ca2+后可发生自降解,引起蛋白酶构象改变;结构域Ⅱ是由Cysl05、His262、Asn286 3个氨基酸残基组成酶的活性中心,这与其它的半胱氨酸激酶类似,如 papain,caspase和cathepsins;结构域Ⅲ是抑制蛋白或激活蛋白结合的部位;结构域Ⅳ是Ca2+结合的部位,包含5个与钙调素类似的EF-hand模体。小亚基有2个结构域,结构域Ⅰ富含甘氨酸和疏水氨基酸,是酶与细胞膜结合的部位;结构域Ⅱ与大亚基结构域Ⅳ结构相似,也含有Ca2+结合位点[2-3]。

2 钙蛋白酶的活性调节

钙蛋白酶的活性依赖于胞浆内Ca2+浓度,不同的钙蛋白酶同工酶对Ca2+浓度要求不同。u-calpain只需微摩尔浓度的Ca2+就可激活,而m-calpain需毫摩尔级的Ca2+浓度才能被激活,正常情况下,细胞内游离Ca2+浓度在0.1～5μmol·L-1之间,主要激活前者[4]。Ca2+对钙蛋白酶的激活过程分为两步,首先是Ca2+与大亚基的结构域Ⅲ,结构域Ⅳ和小亚基的结构域Ⅱ结合,引起大亚基变构。第二步是变构的大亚基的结构域Ⅱ组成酶活性部位水解底物蛋白。

在较高的Ca2+浓度作用下,钙蛋白酶还可以发生自溶作用,分解为只需低浓度Ca2+浓度维持的有活性亚单位。研究发现[5],正常情况下 u-calpain需要 2-200μM 的Ca2+才能激活,然而一旦激活发生自溶时,全长80 k D的u-calpain降解为76 kD或78 k D的片段,该降解片段仅需0.5-2μM 的Ca2+维持活性。与此类似,骨骼肌特异的P94(Calpain3)也可自降解为56 k D、58 k D或60 kD的片段,同样只需较低的Ca2+浓度即可维持。因此,钙蛋白酶的自溶作用对活性起到调节作用,但到目前为止具体机制仍不清楚。

3 钙蛋白酶相关疾病

钙蛋白酶系统作为机体细胞内蛋白降解的主要酶系之一,对维持体内蛋白质代谢的平衡起着重要的作用。钙蛋白酶含量的提高或活性的增强时均可导致蛋白分解大于合成,机体呈现负氮平衡,反之则会导致体内陈旧、毁损的蛋白无法及时更新。上述两种情况下,均可导致细胞结构变化和功能障碍,另外钙蛋白酶还是调节细胞生长,代谢过程的信号转导分子

3.1 钙蛋白酶与骨骼肌萎缩

骨骼肌萎缩过程与肌原纤维蛋白分解增强密切相关,负责肌原纤维蛋白降解的主要是泛素-蛋白酶体和钙蛋白酶系统。泛素-蛋白酶体可以降解细胞内80%以上的胞内蛋白,但对于完整的肌原纤维并不起作用。钙蛋白酶系统系统负责将肌原纤维劈裂成可降解的肌丝片段,而后泛素-蛋白酶体才能降降解这些蛋白[6]。因此,钙蛋白酶可认为是启动骨骼肌肌原纤维蛋白降解第一步的主要酶系。研究发现,去神经、费用等原因造成的肌肉萎缩中均发现钙蛋白酶活性的提高,而过量表达没有活性的m-calpain或者Calpastatin能使大鼠 L8成肌细胞的蛋白降解速率下降30-63%[7],也有研究表明过量表达全长的Calpastatin可使转基因小鼠比目鱼肌萎缩速度下降30%[8]。

3.2 钙蛋白酶与缺血再灌注损伤

缺血再灌注损伤时,胞浆的Ca2+浓度明显增加,进而导致细胞结构损伤和功能代谢障碍,称为钙超载。缺血再灌注损伤时钙超载的机制主要是Na+/Ca2+交换异常和细胞膜和肌浆网膜损伤引起Ca2+内流。Ca2+浓度增加可以激活钙蛋白酶促进细胞膜和结构蛋白的损伤。因此,缺血再灌注损伤时钙超载和生物膜损伤相互促进,形成恶性循环。

研究发现[9]心肌缺血再灌注损伤时Calpain1表达增加,并认为Calpain1劈裂激活PKC在缺血再灌注引起心肌梗死中起重要作用,使用钙蛋白酶抑制剂SNJ-1945可以明显减少缺血再灌注引起心肌损伤[10]。另外有研究发现在肾脏移植缺血再灌注损伤时也有Calpain的激活,使用钙蛋白酶抑制剂同样也起到了很好的预防损伤的作用[11]。

3.3 钙蛋白酶与阿尔茨海默病

阿尔茨海默病又称老年痴呆症。是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病,临床表现为认知和记忆功能不断恶化,日常生活能力进行性减退,并有各种神经精神症状和行为障碍。目前比较认可的两种发病机制为:其一为由于淀粉样前蛋白的异常导致蛋白成分漏出细胞膜,导致神经元纤维缠结和细胞死亡;其二为与载脂蛋白E(APO-E4)的基因有关,APO-E4使神经细胞膜的稳定性降低,导致神经元纤维缠结和细胞死亡。

研究发现阿尔茨海默病患者脑神经细胞钙离子的浓度和钙蛋白酶的活性均上升[12],钙蛋白酶通过劈裂分解周期素依赖激酶-5(CDK-5)和细胞内调节激酶(ERK)激活两者,最终引起细胞凋亡;另有研究发现过量表达钙蛋白酶内源抑制剂Capastatin(CAST)能减少神经元的凋亡,对神经细胞起到明显的保护作用[13]。以上说明钙蛋白酶在阿尔茨海默病的发生发展过程中发挥重要作用。

3.4 钙蛋白酶与糖尿病

随着生活水平的提高,糖尿病发病率有上升趋势,其中2型糖尿病占多数。该型患者机体对胰岛素反应差,因此又称胰岛素抵抗性糖尿病。研究发现2型糖尿病患者的Calpain-2的活性亚单位显著上升[14],这可能是导致胰岛B细胞功能紊乱和凋亡的原因。另外糖尿病的发生除了与饮食有关外,遗传因素也在2型糖尿病的发生中起作用,对于糖尿病的易感基因,研究较多的就是Calpain-10基因。有研究表明Calpain-10基因突变与2型糖尿病患者的发生密切相连[15],Calpain-10编码的蛋白与葡萄糖的摄取、转运有关。

3.5 钙蛋白酶与风湿性关节炎

风湿性关节炎是一种常见的急性或慢性结缔组织炎症,可反复发作并累及心脏。临床以关节和肌肉游走性酸楚、重著、疼痛为特征,属变态反应性疾病,是风湿热的主要表现之一,多以急性发热及关节疼痛起病。研究发现风湿性关节炎患者钙蛋白酶活性增强,钙蛋白酶通过劈裂激活蛋白激酶C(PKC)和炎性介质 IL-1、IL-6、TNF-α等参与风湿性关节炎的发生[16]。而使用钙蛋白酶抑制剂E-64-d则可明显抑制实验大鼠的关节炎[17]。

3.6 其他钙蛋白酶相关的疾病研究进展

除了上述钙蛋白酶相关疾病外,在白内障患者的晶状体中发现Ca2+浓度的提高,钙蛋白酶被激活,组成晶状体的细胞骨架蛋白质、肌动蛋白等被降解,导致白内障。另外,研究发现使用钙蛋白酶抑制剂或敲除calpain-3的小鼠均可以可以阻止白内障的发生[18-19]。此外,在肌营养不良、肿瘤、烧伤等疾病中也发现钙蛋白酶活性的提高[3]。说明钙蛋白酶可能在上述疾病过程中也发挥重要作用,具体机制有待于进一步研究。

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