心肌Cx43在缺血预处理抗心律失常中的作用

陈向来，唐燕华，杨崛圣

（南昌大学第二附属医院胸外科，南昌330006）

缺血预处理（ischemic preconditioning，IP）是细胞自我保护机制的启动过程，1986年C.E.Murry等［1］提出缺血预处理可以减轻心肌缺血再灌注损伤、减少心律失常，但其机理仍未完全阐明。临床上多数心脏病人在术前已有不同程度的心肌肥厚等病变，在经历体外循环直视手术的急性缺血后比正常心肌更容易出现各种心律失常。本实验通过结扎肥厚心肌兔冠状动脉复制心肌急性缺血模型，对其中部分进行缺血预处理，观察其对缺血心肌的保护作用，并从缝隙连接蛋白（Cx43）角度进一步探讨心律失常的发生机制及IP对减少心律失常的作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1）动物：新西兰大耳白兔14只，体质量2.2～2.5kg，由南昌大学实验动物中心提供。2）试剂：苏木素伊红液（南昌大学病理教研室提供），抗Cx43多克隆抗体（博士德公司），SABC（荧光CY3）试剂盒（博士德公司，内容：正常山羊血清5mL，生物素化二抗0.5mL，S ABC－cy3 0.5mL），PBS磷酸缓冲液，纯丙酮、二甲苯、缓冲甘油、无水酒精、中性树胶。3）设备及器材：H2S－D恒温水溶箱（哈尔滨仪器仪表公司），BL－410生物机能实验系统（成都泰盟），实验动物呼吸机（浙江大学医学仪器厂），石蜡及冰冻切片机（英国珊顿），激光扫描共聚焦显微镜（包括荧光显微镜彩色成像输入仪和Image－Analysis图像分析系统）。

1.2 实验方法

1.2.1 模型制备

参照A.F.Cutilleta等［2］的方法建立兔左心室肥厚模型，6周后将左心室肥厚的兔参照汪谦［3］的方法建立兔肥厚心肌急性缺血模型。

1.2.2 实验分组

14只新西兰大耳白兔均制模成功，将其按随机数字表法分为2组，每组7只。1）缺血再灌组（IR组）：闭塞冠状A前降支30min，再灌90min。2）缺血预处理组（IP组）：在缺血前预先缺血5min，再灌5min。

1.2.3 心电图指标的观察和测定

以改良Curtis and Ravingerova评分方法进行评分。1）1分：ST段抬高或QRS波增宽；2）2分：偶发室性早博 （vencreular extrasystole，VE）；3）3分：成对VE、VE二联律三联律或VE≥5次；4）4分：频发VE（1min内VE≥5次）；5）5分：室性心动过速（ventricalar tachycanelias，VT）一阵＜30s；6）6分：VT一连≥30s；7）7分：室颤（vertrianler－fibrielation，VF）多阵累计＞30s；8）8分：VF一连＜5min；9）9分：VF多阵累计＜5min或一阵≥5min；10）10分：VF多阵累计＞5min。

1.2.4 心肌标本的取材与保存

实验操作结束后，立即取动物心脏，滤低吸干血迹，取左冠状动脉前降支发处约0.6cm处取前降支支配区整层心肌一块放入液氮中保存，备冰冻切片，行免疫组化。

1.2.5 Cx43免疫组化

1）所有玻片均行防脱片处理。2）冰冻切片，片厚4μm。取一组冰冻切片，尔后将玻片放入纯丙酮，室温固定20～30min。3）固定完成后放入PBS中，3min×3次。4）洗完后，每张切片标本用免疫组化笔画圈以节省抗体。5）每个标本滴加20μL 10%山羊血清，以消除非特异性抗原。6）10min后不洗，滴加1∶100单抗20μL，PBS稀释后放入湿盒，4℃过液16～18h。7）过液后，PBS 5min×3次。8）弃去PBS液，标本滴加1∶60生物素化二抗20μL。放入37℃电热恒温水浴箱30min。9）取出标本，PBS 5min×3次。10）弃去PBS液，每个标本加1∶120荧光素Cy3 20μL，放入37℃电热恒温水浴箱30min。11）取出玻片，甩去多余液体，加缓冲甘油封片，4℃保存，第2天在荧光显微镜下观看。

1.2.6 图像分析

取玻片，放在倒置荧光显微镜下，每张玻片各取4个视野，亮度对比度均为50，摄片。每个视野以Image－Analysis图像系统进行图像分析。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 2组心电图情况比较

IR组有3例发生VT（VT一阵＜30s、VT一连≥30s、VF多阵累计＞30s各1例），有5例发生VE（其中2例为频发VE，3例为偶发VE），1例未出现明显的心律失常，但有明显的ST段的抬高。IP组有1例发生一阵＜30sVT，之前还曾发生成对VE和频发VE，5例发生VE（其中1例为频发VE，4例为偶发VE），2例未出现明显的心律失常，但有ST段的抬高和QRS波增宽。总体来说IR组发生了较多的室性心律失常，且更为严重，IP组VT明显减少，VE程度减轻。用改良Curtis and Ravingerova评分方法评分，IR组评分为（4.286±1.976）分，IP组评分为（2.286±1.380）分，IP组较IR组评分显著下降（P＜0.05）。

2.2 2组Cx43比较

IR组Cx43面积为（1 443.35±231.46）μm2，IP组Cx43面积为（1 911.72±214.77）μm2，IR 组较IP组显著减少（P＜0.05）。

2.3 Cx43与改良Curtis and Ravingerova评分的相关关系

缺血心肌包括单纯缺血和经过预处理的缺血心肌，以Cx43面积作为因变量（x），改良Curtis and Ravingerova评分值作为结果（y），对二者进行直线分析回归。结果显示，随着心肌Cx43面积水平的升高，Curtis and Ravingerova评分值呈下降趋势，二者存在负相关（r＝－0.683，P＝0.007）。回归方程为：y＝10.137－4.08×10－3x，P＝0.001。

3 讨论

由心肌缺血引发的心律失常，是心外科术后常见的并发症之一。在心外科临床上，多数心脏病人在术前已有不同程度的心肌肥厚等病变，在经历体外循环直视手术的急性缺血后比正常心肌更容易出现各种心律失常。肥厚心肌有不同于正常心肌的供血和心电传导结构，其发生室性心律失常机制尚不完全清楚。资料表明，异常心电活动的发生与缝隙连接通道有关。作为哺乳动物心室工作细胞最重要的缝隙连接蛋白，Cx43是目前研究的最多的一种［4］。G.E.Morley等［5］对 Cx43缺陷鼠采用光标法测定心室的传导性，Cx43缺陷鼠的细胞仅在低水平存在电耦联，细胞间连接的传导性下降了60%，仅显示了较低水平的电耦联。结合以往的资料，人们认为以Cx43为主组成的低阻力通道的电耦联使心肌细胞同步收缩，并通过离子交换发挥调控作用，以此在维持正常节律的电生理中起重要作用，而缝隙连接的结构或功能的改变均可能引发心律失常。

关于IP抗心律失常的机制目前存在2种观点。一种观点认为IP本身不具有直接抗心律失常的作用，它是通过缩小梗死面积和延缓心肌细胞坏死时间从而延缓和减轻了心律失常的发生。但随着研究的深入，发现IP本身能引起心肌组织电生理特性的改变并由此发挥直接抗心律失常的作用［6］。本研究结果发现预处理可减轻缺血再灌注室性心律失常的发生，并减轻缺血再灌注后Cx43表达的下降。本研究对Cx43面积和改良Curtis and Ravingerova评分值进行相关分析，发现随着Cx43面积的增加，评分值呈下降趋势，二者存在负相关关系，提示Cx43在其中起积极作用。

许多研究已证明，蛋白激酶C（PKC）是IP的关键因素，其中的机理之一就是激活ATP敏感性钾通道，（K＋ATP通道），促进 K＋外流，抑制Ca2＋内流，缩短动作电位的过程，降低心肌细胞钙超载，从而起到保护作用。实验证明Cx43为磷酸蛋白，由此笔者推测Cx43在IP减少心律失常中的作用有如下几方面：1）IP激活PKC，通过PKC磷酸化修饰维持Cx43的正常耦连，保证K＋ATP通道开放，促进K＋外流，缩短了造成单向阻滞的时间窗口，起到减少折返性心律失常的作用；2）IP激活K＋ATP通道开放，促进K＋外流，导致细胞外K＋升高，而低钾是诱发触发激动重要原因，因此IP可能通过减轻Cx43表达的下降，减轻由于触发激动而引起的心律失常的发生；3）IP激活K＋ATP通道开放，可使其后缺血1～5min时静息膜电位（RMP）迅速降低，导致再灌注时RMP超极化。减轻由于自律性异常而引起的缺血及再灌注心律失常的发生。

综合而言，IP可能通过心律失常发生的各个环节减轻它的发生，K＋ATP通道开放是IP减少心律失常发生的一个中间环节，而它正是通过Cx43的正常耦连来实现的，因此Cx43可能是IP抗心律失常的结构基础。

［1］ Murry C E，Jennings R B，Reiner K A.Preconditioning with ischemia a delay of lethal cell in injury in ischemic myocardium［J］.Circulation，1986，74（5）：1124－1136.

［2］ Cutilleta A F，Rudnik M，Iak R.Muscle and nonmuscle cell RNA polymerase activity during the development of myocardial hypertrophy［J］.J Mol Cell Cardiol，1978，10：677.

［3］ 汪谦.现代医学实验方法［M］.北京：人民卫生出版社，1997：907.

［4］ Sever N I，Dupont E，Thomas N.Alterations in cardiac connexin expression in cardiom yopathies［J］.Adv Cardiol，2006，42：228－242.

［5］ Morley G E，Vaidya D，Samie F H，et al.Characterization of conduction in the ventricles of normal and heerozyrous Cx43 knockout mice using optical mapping［J］.J Cardiovasc Eleectrophysiol，1999，10：1361－1375.

［6］ Lin I，Li Y，Lin S，et al.The effect of delayed preconditioning on connex in 43in ischemic myocardium［J］.Biochem Cell Biol，2007，85（2）：175－181.