Narc-1在动脉粥样硬化中的表达及意义

张艳平 丁矢 向秋玲 李雪兰 欧勇 袁莉

动脉粥样硬化发生的诸多影响因素中，血脂水平代谢异常是造成动脉粥样硬化死亡率及罹患率增加的主要因素[1]。最近发现，人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proprotein convertase subtilisin/kexin 9，PCSK9)是2003年发现的涉及常染色体显性高胆固醇血症的第三个基因[2]，编码前蛋白转化酶NARC-1(neural apoptosis-regulated convertase 1)。pcsk9基因连锁显示其与常染色体显性遗传的高胆固醇血症有关。目前Narc-1/pcsk9作为一个新的治疗靶点已成为高胆固醇血症和动脉粥样硬化研究的热点，对进一步深入探索新的防治途径具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料30只健康纯种雄性新西兰大白兔由湖南省实验动物中心提供;NARC-1免疫印迹试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司;苏木素复染液以及DAB显色试剂盒均购自福州迈新公司。其他试剂为国产分析纯。DMR+Q550型图像分析仪系德国Leic公司产。

1.2 动物模型建立与实验分组选取5月龄健康纯种雄性新西兰大白兔30只，体质量(2.3±0.8)kg。采用单笼喂养，饮水不限。通过适应性喂养1周后随机分为两组:对照组(A组)15只，给予饲喂普通颗粒饲料;高胆固醇组(B组)15只，给予饲喂常规颗粒饲料中添加5%胆固醇、8%猪油、7%蛋黄粉。两组分别喂养12周。

1.3 病理组织学检测喂养12周末，经耳缘静脉注射空气15～20 ml处死动物后，剖开胸腔及腹腔，将心脏至左右髂动脉分叉处的主动脉离断并纵行剖开，生理盐水冲洗血管壁内外残血，4%多聚甲醛固定，进行苏丹Ⅲ染色，取远端1.5 crn处组织放入液氮中保存，用于免疫印迹。免疫印迹分析按照试剂盒的说明进行。应用图像分析系统测定斑块面积。

1.4 统计学方法采用SPSS 13.0统计软件，数据以±s表示，组内及组间对照采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高胆固醇对主动脉内膜的影响肉眼下正常对照组管腔面光滑，无脂质沉积;高胆固醇组出现了明显的动脉粥样硬化病变，脉管壁大量干酪样脂质斑块物质凸向管腔。经图像分析仪检测，高胆固醇组主动脉内膜面粥样硬化病变面积为(27.41±2.12)%，与对照组(0.51±0.20)%相比显著升高，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 形态学改变光镜下正常对照组内皮细胞完整，管腔内皮光滑，血管壁层次清晰，无明显增生。高胆固醇喂养组动物血管壁结构紊乱，内皮细胞肿胀、变性，部分缺失;内膜明显增厚，内含大量泡沫细胞，内弹力膜断裂，可见斑块形成;中膜不规则增生，平滑肌细胞排列紊乱，胞体变大，可见钙化斑，斑块中大量炎性细胞浸润。

2.3 主动脉NARC-1表达的比较免疫组化显示正常对照组主动脉组织中仅见少量棕色染色颗粒，高胆固醇组主动脉组织中NARC-1呈强阳性表达，尤以斑块中的表达最为明显。高胆固醇喂养组动物主动脉中NARC-1的表达(7532±323)pixel intensity/mm2/μg较正常对照组(1532±452)pixel intensity/mm2/μg显著升高，经t检验，两组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)。

3 讨论

血脂代谢水平紊乱是造成动脉粥样硬化性心脏病的最主要的危险因素，而血液中脂质代谢异常为多个基因之间或多个基因与环境因素之间相互作用的结果。近来研究发现，Narc-1/pcsk9主要作用是通过负调节细胞表面的LDLR表达来减少LDL肝摄取，从而使血浆LDL清除减少和LDL-胆固醇(LDLC)升高[3]。PCSK9在内质网中以可溶性酶原的前体形式合成，经过分子内自我催化加工生成成熟蛋白后分泌到血浆中发挥其自身作用[4]。大量的临床流行病学资料一致证实，高LDL胆固醇血症是一个已被确认的独立危险因素，表明血清低密度脂蛋白胆固醇升高可诱发和促进动脉粥样硬化的发生、发展[5]。本实验采用高胆固醇颗粒食物喂养动物12周后，肉眼下高胆固醇组出现了明显的动脉粥样硬化病变，脉管壁大量干酪样脂质斑块物质凸向管腔，经检测主动脉内膜面粥样硬化病变面积(27.41%±2.12)%较正常对照组(0.51%±0.20%)相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。结果证实高脂食物确实是诱发动脉硬化发生的因素之一。

有研究发现PCSK9突变引起常染色体显性高胆固醇血症，PCSK9突变形式多样，有PCSK9基因错义突变的人群，其血浆LDLC水平明显降低，表明抑制PCSK9的活性有助于增加LDLR数量[6]。同样的研究结果也出现在PCSK9基因敲除小鼠实验中，PCSK9基因敲除小鼠的肝细胞LDLR受体数量明显增多，并加速了血浆LDL的清除，从而降低了LDLC水平[7]。然而无论是野生型还是突变体，PCSK9的过表达都是通过翻译后机制来降低LDL-R的水平。本实验通过建立动脉硬化动物模型，检测出动脉硬化组动物主动脉内膜NARC-1蛋白的表达(7532±323)pixel intensity/mm2/μg较正常对照组(1532±452)pixel intensity/mm2/μg显著升高，且差异具有统计学意义(P＜0.05)。证实NARC-1与动脉粥样硬化的发生是相关的。

目前，有国外文献认为PCSK9从两方面影响血浆中LDLC的水平，一是维持合适的LDLR水平;二是调节apoB的分泌量。Narc-1/pcsk9可通过调节细胞表面低密度脂蛋白受体(LDLR)，PCSK9和LDLR也共同受到胆固醇的调节，PCSK9是通过调节LDLR功能另一新的旁路机制，还是经典的通过SREBP介导的胆固醇抑制转录效应，还有待我们深入研究探讨，也能为动脉粥样硬化的研究提供更有效地药物防治方法和途径。

[1]Douglas MR，Lewthwaite AJ，Nieholl DJ.Genetics of Parkinson's disease and parkinsonism.Expert Rev Neurother，2007，7(6):657-666.

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[3]蔺洁，王绿娅，夏军辉，等.家族性高胆固醇血症患者新的致病基因——PCSK9基因突变分析.中国动脉粥样硬化杂志，2007，15(7):612-615.

[4]Fasano T，Sun XM，Patel DD，et al.Degradation of LDLR protein mediated by'gain of function'PCSK9 mutants in normal and ARH cells.Atherosclerosis，2009，203(1):166-171.

[5]Bedi M.Niesen D.Inhibition of squalene synthase upregulates PCSK9 expression in rat liver.Arch Biochem Biophys，2008，470(2):116-119.

[6]Cameron J.Holla OL，Lacrdahl JK，d 02.Mutation s462P in then-PCSK9 gene reduces secretion of mutant PCSK9 without affecting the autoeatalutlccleavage.Atheroaclerbsis，2009，203(2):161-165.

[7]Steinberg D，Witztum JL.Inhibiton of PCSK9:A powerful weapon for achieving ideal LDL eholesterol levels.Proe Nail Aead Sei USA，2010，106(24):9546-9547.