细菌鞭毛素对植物免疫防卫反应及其信号机制的激发

武晓丽, 陈华民, 吴茂森, 何晨阳

(中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193)

研究表明,对植物接种致病菌或病原菌产物可以使植物获得相关病害的免疫特性,植物对病原物侵染的忍耐、抵抗和适应性是在两者共同进化过程中逐渐产生和形成的。由于植物体不具备类似动物的免疫系统,寄主植物常依赖自身的先天免疫(innate immunity)系统来抵御病原物的侵染[1]。植物先天免疫系统通过探测病原物相关分子模式(pathogen-associated molecular pattern,PAMP)而被激活,使植物表现抗性[2]。PAMP是进化上保守的,来源于病原物而非植物本身的分子,如病原物鞭毛素、脂多糖、葡聚糖和几丁质分子,都可以激发植物的防卫反应。目前研究较多的是细菌鞭毛素和EF-Tu、卵菌七葡聚糖、真菌木聚糖酶[3-6]。由于非病原物也可以产生这类分子,所以又提出了MAMP(microbe-associated Molecular pattern)的概念;凡是进化保守的,来源于微生物可激发寄主植物防卫反应的分子称为MAMP[7]。

与动物的免疫机制不同,植物依靠每个细胞的先天免疫性和病原物侵染位点产生的系统信号来抵御病原物的入侵。目前认为植物被诱导的抗病性主要包括两部分[8]：第1部分是植物依靠分子模式识别受体(pattern recognition receptor,PRR)识别进化上保守的PAMP,从而激发植物的PTI(PAMP-triggered immunity)反应。PTI反应可抑制病原菌侵染植物体,同时病原菌也进化出了抵抗植物PTI的机制,病原菌通过干扰PRR与PAMP的识别,或将效应蛋白注入植物体来抑制PT I反应;同时,植物也形成了更加特异的识别机制,从而引发了第2部分抗性：ETI(effector-triggered immunity)反应,ETI反应也被认为是一种扩大了的PTI反应,称为过敏反应(hypersensitive response,HR),这种反应通常是为了抑制病原菌的侵入而形成的一种程序化细胞死亡[9]。PTI和ET I均是重要的植物抗性反应,PTI抗性可以抑制大范围的病原菌感染[10],ETI抗性则能在植物体内形成过敏反应,可造成侵染位点细胞的迅速死亡,这种抗性即称为基因对基因抗性(gene-for-gene resistance)。但ETI反应通常只局限于某个植物种类的某些成员,而非所有成员,这种抗性是不持久的,因为病原菌会生成新的效应蛋白来维持对植物的致病性[11]。

鞭毛是细菌的主要运动器官,同时也是一种重要的致病因子。鞭毛素(flagellin)是组成鞭毛丝的亚基,可形成纤丝结构,鞭毛素可作为PAMP因子被寄主识别,从而诱发植株一系列防卫反应。本文将结合本实验室水稻白叶枯病菌相关的研究进展,综述近年来鞭毛素激发植物免疫反应方面的最新研究成果。

1 鞭毛素的识别位点

1.1 鞭毛素flg22诱导植物细胞防卫反应

丁香假单胞菌烟草变种菌体粗提物经煮沸灭活后,可刺激烟草悬浮细胞产生碱化反应;经分离纯化、测序后,发现粗提物中的有效成分是鞭毛素[12]。自此,鞭毛素作为一种可引发植物细胞防卫反应的PAMP因子开始为人们所熟知。进一步的研究发现,多种病原菌鞭毛素的 N端呈现高度保守性。flg22是人工合成的鞭毛素N端22个氨基酸肽段,具有比鞭毛素更强的活性,能够激发植物细胞各种防卫反应。因此,flg22被认为是鞭毛素的活性位点,是激发植物细胞抗性反应的关键区段。动物细胞识别鞭毛素的位点不同于植物细胞,引起哺乳动物炎症反应的病原菌鞭毛素保守的N-末端及C-末端均与植物病原菌鞭毛素存在较大差异,而且动物细胞识别的鞭毛素保守位点对于细菌的运动性发挥着更为重要的作用[13]。

尽管细菌flg22区段是高度保守的,但个别氨基酸残基是可变的。根癌土壤杆菌和青枯病菌鞭毛素flg22区段某些氨基酸残基变异后,不能诱导植物细胞的防卫反应[12,14]。甘蓝黑腐病菌鞭毛素flg22的第43位氨基酸残基是诱导拟南芥防卫反应的关键位点;当该位点的天冬氨酸残基发生变异后,鞭毛素就会失去诱导拟南芥防卫反应的能力[15]。

1.2 鞭毛素flg22以外区域诱导植物细胞防卫反应

在植物-病原菌互作过程中,鞭毛素flg22外区域也具有诱导植物防卫反应的能力。可侵染水稻、燕麦、玉米等植物的广寄主病原菌燕麦食酸菌水稻亲和菌株、鞭毛素及flg22区段均不能诱导水稻细胞防卫反应,而燕麦食酸菌水稻非亲和菌株及鞭毛素则可诱导水稻细胞防卫反应,但非亲和菌株鞭毛素的flg22区段却不能诱导水稻细胞防卫反应,说明鞭毛素诱导水稻防卫反应的机制与flg22诱导拟南芥等十字花科植物是不同的[16-17]。在这两种机制中,鞭毛素以及flg22区段以外的氨基酸序列所发挥的作用还是未知的。

丁香假单胞菌烟草变种鞭毛素粗提物不能激发水稻细胞的防卫反应[12]。本室研究表明,亲和的水稻白叶枯病菌以及不亲和的番茄斑点病菌鞭毛素氨基酸序列同源性高达98.72%,均不能激发水稻细胞的防卫反应;两者与可引发水稻防卫反应的燕麦食酸菌菌株的鞭毛素同源性较低,分别为62.35%和52.54%(本室资料)。表明鞭毛素引发水稻等单子叶植物防卫机制以及鞭毛素作用位点有待深入研究。

2 鞭毛素flg22的受体

2.1 flg22的受体FLS2

动物细胞引发原初免疫反应最重要的PRR类受体蛋白是TLR(toll-like receptor)。TLR是一类位于细胞膜、富含亮氨酸重复单元(leucine-rich repeat,LRR)的受体蛋白。迄今已鉴定出11种TLR受体蛋白,其中TLR5被认为是鞭毛素受体[13]。通过筛选对鞭毛素不敏感的拟南芥突变体,发现了植物细胞中的鞭毛素受体FLS2[18]。FLS2编码的是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,是一类富含亮氨酸重复序列(LRR)的跨膜受体类激酶(receptor-like kinase,RLK)。FLS2与TLR5的结构具有一定的相似性,均含有一个胞外 LRR结构域,但 TLR5具有胞内TIR区域,而FLS2却没有,而且两者与鞭毛素的结合位点及下游反应组分也不同[19]。

近年来,已通过化学交联和免疫沉淀的方法证实FLS2与flg22之间的互作[5]。FLS2识别flg22后可诱发植物细胞内一系列的防卫反应[20],FLS2的磷酸化对鞭毛素flg22的识别以及下游信号的产生是必需的,缺失FLS2的拟南芥突变体植株对病原细菌更加敏感[21]。

2.2 FLS2的细胞内吞作用

当位于质膜的FLS2识别flg22后,细胞就会发生内吞作用,将Fls2-flg22复合体转移至细胞囊泡之中[22]。激酶抑制剂K 252a能够抑制FLS2发生内吞作用,这说明FLS2的磷酸化在内吞作用中发挥重要作用。将FLS2的3个苏氨酸残基突变为丙氨酸后发现,FLS2虽然还能够与flg22结合,但却不能发生内吞作用[23]。内吞作用对flg22信号的传递具有重要作用,flg22诱导的经渥曼青霉素预处理的拟南芥细胞培养基中MAP激酶活性显著降低,但活性氧猝发却没有受到影响,说明FLS2细胞内吞作用在flg22诱导植物细胞早期防卫反应中可能不发挥作用,但在信号传递过程中是必需的[24]。

3 flg22诱导的防卫反应

3.1 flg22诱导的早期防卫反应

flg22可诱导植物细胞多种防卫反应,其中早期的反应包括：离子流的产生(表现为细胞培养基碱化),活性氧(ROS)的猝发,一氧化氮(NO)的产生,以及胼胝质沉积等多种反应。

介质碱化是包括flg22在内的激发子处理植物细胞发生的最早期事件之一,已经广泛作为研究激发子诱导植物细胞防卫反应的指标[12,25-26]。早前的研究多认为胞外碱化是活性氧引起脂膜过氧化,造成膜结构改变进而引起电解质渗漏造成的[27],目前已基本确定胞外碱化是细胞发生的积极生理反应,由钾离子和氢离子的交换引起的;同时钙离子和氯离子也可能参与了反应[28]。

ROS猝发是植物细胞受到病原物及flg22等激发子的刺激最早出现的标志性反应之一[12,29]。研究表明,植物受到病原物侵染数分钟或数小时内,在叶绿体和线粒体质子运转过程中和过氧化物体的光氧化胁迫中产生大量活性氧[30]。此外,钙离子的浓度对植物细胞ROS的激活是至关重要的[31]。

NO是一种广泛分布于生物体内的气体活性分子,同时也是细胞内及细胞间的重要信号分子,具有多种生理功能,因在动物细胞中发挥的重要作用得到了广泛关注,而后NO在植物细胞中的作用也陆续被人们揭示。NO是植物防卫反应的重要信号分子,促进了过敏性坏死反应的产生和抗病反应的激活。在转录水平上,NO能够调节多个防卫基因的表达,包括编码PR蛋白和次级代谢的相关蛋白[32]。在flg22处理的拟南芥细胞内可检测到NO信号分子的存在[33]。

植物细胞壁的乳突是由于胼胝质、富含脯氨酸的糖蛋白和其他物质在细胞壁上沉积所形成的结构[34],乳突的形成增加了细胞壁的厚度,而胼胝质沉积则可使细胞壁进一步增厚,进而增强植物细胞抵御病原菌入侵的能力。经flg22处理的拟南芥幼苗24 h后,在子叶和茎部组织都发现了胼胝质沉积现象[35],说明flg22可诱导植物细胞的抗病反应。

3.2 flg22诱导的MAPK级联反应

flg22被FLS2识别,诱导了植物细胞一系列的早期防卫反应后,会进一步激活MAPK(mitogenactivated protein kinase)级联反应,诱导防卫基因的表达。MAPK级联反应通常涉及3种功能连锁的蛋白激酶,分别是MAPK激酶激酶(MAPKKK)、MAPK激酶(MAPKK)以及MAPK。这3种激酶按照MAPKKK-MAPKK-MAPK的顺序依次被磷酸化激活,一旦MAPK被激活,就可以磷酸化下游的特异蛋白,进而引发细胞内反应[36]。

用flg22处理拟南芥原生质体后,激发的MAPK级联反应激酶主要由MAPK激酶激酶MEKK 1,MAPK激酶MKK 4/5和MAP激酶MPK 3/6构成,在这个MAPK级联反应中,具有活性的MEKK 1特异的依次激活了 MKK 4/5和MPK 3/6,最终导致位于FLS2下游的特异性转录因子WRKY 22/WRKY 29被磷酸化[37]。flg22除可激发MPK3/6外,还可诱导MPK 4的活性,故拟南芥中很可能还存在着MEKK1-MKK 1/2-MPK 4这样一个平行于MEKK 1-MKK 4/5-MPK 3/6的MAPK级联反应途径[38]。虽然这些研究结果目前尚未有统一的定论,flg22激发的MAPK级联反应通路也没有得到最终的确认,但以上结论均证实鞭毛素flg22区段可有效地诱导植物细胞发生MAPK级联反应。

3.3 BAK 1介导的flg22信号传导

BAK 1是一个具亮氨酸重复的RLK(receptorlike kinase),涉及了FLS2的信号传导[39]。在bak1拟南芥突变体中,FLS2与flg22表现正常的结合能力,但flg22诱发的早期和后期防卫反应却明显降低,表现为 AOS的产生大大降低,MAPK 3和MAPK 6的激活也受到了抑制,说明BAK 1可能正调控了flg22所引起的防卫反应。其调控机制可能为BAK 1可以在植物细胞感受flg22刺激后,迅速地结合在FLS2-flg22的复合体中,形成 BAK 1-FLS2-flg22复合体,进而促进了flg22诱导的下游防卫反应的发生[39-40]。

3.4 flg22诱导防卫基因的表达

除可激发植物细胞MAPK级联反应外,大量的试验证据表明flg22还可诱发一系列防卫基因的表达,如早期基因 WRKY22/29、FRK1等;晚期基因PR1/5等[37]。经 flg22处理的拟南芥细胞中,约1 000个基因上调表达,约200个基因下调表达,其中RLKs、WRKY转录因子及一些受体蛋白基因的上调表达,表明植物细胞已经引发了对病原菌入侵的原初防卫反应,而一些与植物激素代谢有关的基因发生下调表达则表明细胞的分化及生长可能会被抑制[41]。

4 结束语

对于PAMP所激发的植物细胞防卫反应及信号传导通路的研究一直是分子植物病理学所关注的问题之一,随着大量研究成果的涌现,为植物-病原菌互作机理的深入揭示提供了可靠的依据。鞭毛素flg22作为研究最为深入的PAMP分子之一,为探索植物免疫反应机制提供了诸多有价值的理论依据,特别是flg22受体FLS2可发生细胞内吞作用,是植物中首次发现的PAMP受体细胞内吞现象。这种类似的现象在动物细胞中也有发现,这说明受体蛋白的细胞内吞作用可能是在动植物细胞中普遍存在的一种现象,而其在动植物免疫反应及获得抗性的过程中发挥的作用还不清楚,相信随着研究的不断深入,其机制会得到进一步阐明。

对于flg22激发植物免疫反应的信号传导途径目前还没有明确的结论。研究表明,该通路与多种植物激素介导的防卫反应信号通路相关联;此外,鞭毛素诱导水稻等单子叶植物防卫反应的机理研究还不是很深入,对于鞭毛素与单子叶植物互作的活性位点以及在细胞中的受体的研究都将成为今后的重点。

[1]Nu rnberger T,Brunner F,Kemmerling B,et al.Innate immunity in plants and animals：striking siMilarities and obvious differences[J].Immun Rev,2004,198：249-266.

[2]Underw ood W,Zhang S,H e S Y.The Pseudomonassyringae typeⅢeffector ty rosine phosphatase HopAO1 suppresses innate immunity in Arabidopsis tha liana[J].Plant J,2007,54(4)：658-672.

[3]Maruyama N,Mohamed Salleh MR,Takahashi K,et al.Stru cture-phy sicocheMical function relationshipsof soybean beta-cong lycinin heterotrimers[J].JAg ric Food Chem,2002,50：4323-4326.

[4]Ron M,Avni A.The receptor for the fungal elicitor ethyleneindu cing xylanase is a member of a resistance-like gene faMily in tomato[J].Plant Cell,2004,16：1604-1615.

[5]Chinchilla D,Bauer Z,Regenass M,et al.The Arabidop sis receptor kinase FLS2 binds flg22 and deterMines the specificity of flagellin perception[J].Plan t Cell,2006,18：465-476.

[6]Zipfel C,Kunze G,Chinchilla D,et al.Percep tion of the bacterial PAMP EF-Tu by the receptor EFR restrictsagrobacterium-mediated transformation[J].Cell,2006,125：749-760.

[7]Akira S,Takeda K.Toll-like receptorsignaling[J].Nat Rev Immunol,2004,4：499-511.

[8]Jones JD,Dang J L.The plant immune system[J].Natu re,2006,444：323-329.

[9]Bittel P,Robatzek S.Microbe-associated molecular patterns(MAMPs)probe plant immunity[J].Cu rr Opin Plant Biol,2007,10：335-341.

[10]Thordal-Christensen H.Fresh insights into processes of nonhost resistance[J].Cu rr Opin Plant Biol,2003,6：351-357.

[11]Dang J L,Jones JD.Plant pathogens and integrated defense responses to infection[J].Nature,2001,411：826-833.

[12]Felix G,Duran J D,Volko S,et al.Plants have a sensitive perception sy steMfo r the most conserved doMain of bacterial flagellin[J].Plan t J,1999,18：265-276.

[13]Smith K D,Andersen-Nissen E,Hayashi F,et al.Toll-like receptor 5 recognizes a conserved site on the flagellin required for protofilament formation and bacterialMotility[J].Nat Immunol,2003,4：1247-1253.

[14]Pu fund C,Tans-Kersten J,Dunning F M,et al.Flagellin is not amajor defense elicito r in Ra lstonia so lanacearuMcells or extracts applied to A rabidopsis tha liana[J].Mol Plan t Microbe,2004,17：696-706.

[15]SunW X,Dunning FM,Pfund C,et al.Within-species flagellin polyMorphisMin Xanthomonas campestris pv.campestris and its impact on elicitation of Arabidop sis flagellin sensing2-dependent defenses[J].The Plant Cell,2006,18：764-779.

[16]Che F S,Nakajima Y,Tanaka N,et al.Flagellin froman incoMpatible strain of Pseudomonasavenae induces a resistan ce response in cultu red rice cells[J].JBiolChem,2000,275(41)：32347-32356.

[17]Tanaka N,Che F S,Watanabe N,et al.Flagellin froman incoMpatible strain of Acidovorax avenae mediates H2O2generation accompanying hy persensitive cell death and expression of PA L,Cht-1,and PBZ1,but not of LOX in rice[J].Mol Plan t Microbe,2003,16(5)：422-428.

[18]Gomez-Gomez L,Boller T.FLS2：an LRR receptor-like kinase involved in the perception of the bacterial elicitor flagellin in Arabidop sis[J].Mol Cell,2000,5：1003-1011.

[19]Ausubel F M.A re innate immune signaling pathw ays in plants and animals conserved?[J].Nat Immun,2005,6：973-979.

[20]Bauer Z,Gomez-GoMez L,Boller T,et al.Sensitivity of different ecoty pes and mu tants of Arabidop sis tha liana tow ard the bacterialelicitor flagellin correlates with the presence of receptor-binging sites[J].JBiol Chem,2001,276：45669-45676.

[21]Gomez-Gomez L,Bauer Z,Boller T.Both the ex tracellular leucine-rich repeat doMain and the kinase activity of FLS2 are required for flagellin binding and signalling in Arabidop sis[J].Plant Cell,2001,13：1155-1163.

[22]Robatzek S.Vesicle trafficking in plant imMune responses[J].Cell Microbiol,2007,9(1)：1-8.

[23]Robatzek S,Chinchilla D,Boller T.Ligand-indu ced endocy tosisof the pattern recognition recepto r FLS2 in Arabidop sis[J].Genes Dev,2006,20：537-542.

[24]Chinchilla D,Boller T,Robatzek S.Flagellinsignalling in plan t immunity[J].Adv Exp Med Biol,2007,598：358-371.

[25]Felix G,Regenass M,Boller T.Specific perception of subnanomolar concentrationsof chitin fragements by tomato cells：induction of ex tracellu lar alkalinization,changes in protein phosphorylation,and establishment of a refracto ry state[J].Plant J,1993,4：307-316.

[26]Schaller A,Oecking C.Modulation of plasmamembrane H+-A TPase activity differentially activates wound and pathogen defense responses in tomato plants[J].Plant Cell,1999,11(2)：263-272.

[27]Keller B U,Hedrich R,Raschke K.Voltage-dependent anion channels in the plasma membrane of guard cells[J].Natu re,1989,341：450-453.

[28]Boller T.CheMoperception of microbial signals in plan t cells[J].Annu Rev Plan t Physiol Plant Mol Biol,1995,46：189-214.

[29]Lamb C,Dixon R A.The oxidative burst in p lan t disease resistance[J].Annu Rev Plant Phy siol Plant Mol Biol,1997,48：251-275.

[30]Desikan R,Mackerness S A,H an cock J T,et al.Regu lation of the Arabidop sis transcriptome by oxidative stress[J].Plan t Physiology,2001,127：159-172.

[31]W hite P J,Broadley MR.CalciuMin plants[J].Annals of Botany,2003,92：487-511.

[32]ParaniM,Rudrabhatla S,Myers R,et al.Microarray analysis of nitric oxide responsive transcrip ts in A rabidopsis[J].Plan t Bio J,2004,2：359-366.

[33]Zeidler D,Zahringer U,Gerber I,et al.Innate immunity in Arabidopsis thaliana：lipopolysaccharides activate nitric oxide synthase(NOS)and induce defense genes[J].Proc Natl Acad Sci USA,2004,101：15811-15816.

[34]Bestwick C S,Bennett MH,Mansfield JW.H rp mutant of Pseudomonas syringae pv.phaseolicola induces cell wall alterationsbut not meMbrane damage leading to the hypersensitive reaction in lettu ce[J].Plant Phy siol,1995,108：503-516.

[35]Gomez-Gomez L,Felix G,Boller T.A single locusdetermines sensitivity to bacterial flagellin in Arabidop sis tha liana[J].Plant J,1999,18：277-284.

[36]Pedley K F,Martin G B.Role ofmitogen-activated protein kinases in plant immunity[J].Cu rr Opin Plant Biol,2005,8：541-547.

[37]Asai T,Tena G,Plotnikova J,et al.MAP kinase signalling cascade in A rabidopsis innate immunity[J].Nature,2002,415：977-983.

[38]Meszaro T,H elfer A,H atzimasoura E,et al.The Arabidop sis MAP kinase kinase AKK 1 par ticipates in defense responses to the bacterialelicitor flagellin[J].Plant J,2006,48：485-498.

[39]Chinchilla D,Zipfel C,Robatzek S,et al.A flagellin-indu ced coMplex of the recep tor FLS2 and BAK 1 initiates plan t defense[J].Natu re,2007,488：497-500.

[40]H eese A,H ann D R,GiMenea-Ibanez S,et al.The receptorlike kinase SERK 3/BAK 1 is a cen tral regulator of innate immunity in plants[J].Proc Nati Acad Sci USA,2007,104：12217-12222.

[41]Zipfel C,Robatzek S,Navarro L,et al.Bacterial disease resistance in A rabidopsis th rough flagellin perception[J].Nature,2004,428：764-767.