Ⅵ型分泌系统与革兰氏阴性病原细菌致病性的关系

张丽勍, 许景升, 徐 进, 冯 洁

(中国农业科学院植物保护研究所,植物病虫害生物学国家重点实验室,北京 100193)

病原细菌通常利用蛋白的分泌来介导与寄主植物的相互作用[1]。革兰氏阴性病原细菌能够通过精细的装置将蛋白运送到胞外,或直接运输到寄主细胞中,这些精细的装置称为分泌系统。目前为止,发现在革兰氏阴性病原菌中至少存在着6种不同类型的分泌系统(Ⅰ～Ⅵ型分泌系统),这些分泌系统通过分泌或注射的方式释放胞外蛋白或效应子,以刺激或干扰寄主细胞的活动,从而能够调控一系列的病原细菌—寄主细胞的相互作用。Ⅰ型分泌系统负责释放多种胞外蛋白和胞外酶[2];Ⅱ型分泌系统从病原细菌内部分泌蛋白到外部,降解寄主细胞组分[3]。Ⅲ型分泌系统和Ⅳ型分泌系统注射效应子到寄主细胞中[4-5]。Ⅴ型分泌系统具有最简单的蛋白分泌机制,通常只分泌单一特殊的细菌效应子[6]。

其中,Ⅱ和Ⅴ型分泌系统的底物蛋白都需要一个N末端信号肽,以便于利用Sec路径从细胞质转运到周质。相反Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型分泌系统,它们不需要信号就能泌出蛋白。Ⅱ～Ⅳ型分泌系统是大型的多蛋白复合体,可以跨越整个细胞膜结构。尤其是Ⅲ和Ⅳ型分泌系统参与了细菌和真核细胞的相互作用及细菌效应分子直接输入到真核细胞质的过程。这两个分泌系统的编码基因一般分布在大的基因簇中,通常称为致病岛。

1 新型的分泌系统—Ⅵ型分泌系统的发现

2006年,科学家报道了在霍乱弧菌(Vibrio cholerae)和铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)中存在一种新型的分泌系统,并将其命名为Ⅵ型分泌系统[1,7]。尽管Ⅵ型分泌系统是在2006年命名的,但是有关该系统存在的研究可以追溯到十年前。1996年,经研究发现,霍乱弧菌中的H cp(haemolysin co-regu lated p rotein),与霍乱弧菌中其他泌出蛋白不同,它的分泌不需要信号肽的剪切过程[8]。1997年,在豌豆根瘤菌(RhizobiuMleguminosarum)中发现一个对豌豆根瘤具有负调控作用的染色体位点,后来被命名为imp(impaired in nodulation)位点,即现在的Ⅵ型分泌系统[9]。1998年,Wang等鉴定出在铜绿假单胞菌中的一个编码丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine protein kinase STPK)的侵染诱导基因,位于icMF基因下游,其在由铜绿假单胞菌引起的鼠中性白细胞减少症中具有重要的作用[10]。同年,从嗜肺性军团杆菌(Legionella pneumophila)染色体中发现icmGCDJBF基因簇,icmGCDJBF是嗜肺性军团杆菌icm杀死巨噬细胞所必需的[11]。2000年,来自印度加尔各答的Das等人在研究霍乱弧菌侵染兔回肠模型中,发现icMF同源物[12]。

该保守的基因簇后来被认为是T6SS座位,开始引起人们的关注。2002年,Pallen等进行了一项细菌蛋白研究,该细菌蛋白包含FHA(forkhead-associated)结构域,已知与 STPKs的靶标可逆结合[13-14]。他们注意到致病的或共生的革兰氏阴性细菌具有一个保守性较高的基因簇,该基因簇均含有一个编码FHA结构域的基因。这些簇中的一些基因同样可以编码一个STPK和一个丝氨酸-苏氨酸蛋白磷酸酶(serine-threonine protein phosphatase,STPP),从而认为FHA结构域参与了依赖磷酸化作用的信号转导。同年,Swedish等在伤寒沙门菌(Salmonella enterica)中发现新的基因组岛(Sa lmonellaenterica centisome 7 genoMic island),它与其他的icmF簇相关联,研究结果表明这个岛的缺失降低了S.enterica进入真核细胞的能力[15]。

2003年,Das等通过对Ⅵ型分泌系统基因座位的生物信息学分析,提供了第一手详尽的资料[16],他们将T6SS基因簇命名为IAHP(IcMF-associated hoMologous protein)簇,这些基因簇是通过它们是否编码IcMF同源物来定义的。尽管IcmF与嗜肺性军团杆菌的Ⅳ型分泌系统有关,但是大多数被编码的蛋白与Ⅳ型分泌系统的组成蛋白并不同源。IAHP蛋白在分泌中的作用被接下来的一个研究所证实。该研究表明来自豌豆根瘤菌的iMp基因簇在依赖环境的蛋白分泌中起作用[17]。2004年和2005年,新加坡Leung研究组的工作表明,鱼的病原细菌Edwardisella tarda中的Evp蛋白在其致病过程中起作用,并且推测它们可能是一个新的分泌机制的组成部分[18-19]。到2005年底,Parsons等证明Salmonella的IcMF同系物SciS,具有控制胞内细菌水平和削弱毒性的能力[19],而且类似ClpB蛋白(ClpV家族)的一个新的种类已经被发现并且证实与细菌-寄主细胞的相互作用有一定的联系[20]。

2 Ⅵ型分泌系统与革兰氏阴性病原菌致病性的关系

目前关于T6SS与革兰氏阴性病原菌致病性的关系尚无深入的研究,但是T6SS对细菌毒力的影响在许多种类中都已有报道。具有T6SS的细菌均属于革兰氏阴性菌的变形菌纲,且多数存在于有毒种类中。例如,在霍乱弧菌中,无毒力的V.fischeri和V.harvey不含有T6SS基因,而具有毒力的V.parahemoly ticus和 V.fu lvinicus则含有 T6SS基因。T6SS缺失的霍乱弧菌突变体能够大大减弱细菌细胞对寄主盘基网柄菌(DictyosteliuMdiscoideum)的毒性。相关试验表明,Sa lmonella中T6SS的VgrG蛋白在细菌致死作用中起着重要作用[21]。而在爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)中,T6SS分泌系统的组分蛋白EvpP在该菌的侵染过程中,起着至关重要的作用,并且是减毒活疫苗的潜在靶标[22]。土拉弗朗西斯菌(Francisella tu larensis)中,IglA-IglB复合体的形成(其中iglA和iglB在大多数T6SSs中是保守的)对于其致病性起关键作用[23]。因此推测T6SS与病原菌的致病性有非常密切的关系。

3 Ⅵ型分泌系统的作用机制

T6SS编码基因以基因簇形式存在,该基因簇通常编码12～25个蛋白,T6SS基因簇在至少16个革兰氏阴性菌变形菌纲中存在[24]。T6SS的另一个典型特点是其基因簇编码Ser/Thr激酶和磷酸酶。

3.1 Ⅵ型系统分泌的效应子

目前已知,Ⅵ型系统与Ⅲ型和Ⅳ型分泌系统一样均向外输出称为效应子的蛋白[25]。这些效应子具有调节多种细胞功能的作用。效应子与细菌毒性因子不同,细菌毒性因子通常具有单一的生化活性,直接在特异性的细胞靶标上发挥作用;而效应蛋白则是与通过同一分泌系统的其他的多种细菌效应子协同作用,从而发挥出特异性的功能[26]。

所有T6SS效应分子的直向同源基因均缺乏典型的N末端信号肽[27]。目前,已知H cp(haemolysin co-regu lated p rotein)和VgrG(valine g lycine repeat)蛋白家族是T6SS中的效应子。两者在携带有T6SS基因簇细菌的培养上清液中发现[1,28-29]。

依赖T6SS系统分泌的VgrG蛋白首先是在霍乱弧菌中发现的[7]。所有的VgrG蛋白的源基因均具有一个C末端信号肽。经研究发现,VgrG蛋白与T4噬菌体尾突的gp5/gp27蛋白具有相似性,尾突结构是噬菌体用来刺穿细菌的膜结构从而允许噬菌体将DNA注射到细胞内。VgrG分子具有双重功能,既是膜穿刺结构的组成部分,还可以作为效应分子起作用。

H cp首先是在霍乱弧菌中发现的[7],在铜绿假单胞菌中得到再次确认[1],目前在所有具有 T6SS的细菌中均存在H cp。此外,H cp蛋白已经被证明在胞外可以形成六聚环的结构[1],并且推测其能在细菌细胞表面组装成一个通道,延伸或包围在VgrG蛋白形成的管道周围,从而使得其他的效应分子可以运输到寄主细胞。

由于分泌蛋白的这些结构特点,推测 T6SS形成了一个穿透寄主细胞膜的通道。

最新的研究验证了铜绿假单胞菌的3个毒素,包括通过依靠T6SS方式分泌的毒素Tse2[30]。这3个毒素阻挡它们的产物使其不去影响H cp分泌到细胞培养上清液中。目前仍旧缺乏有关T6SS效应子转移到靶标细胞中的直接证据[31]。然而,铜绿假单胞菌的细胞中含有一个能够起作用的T6SS,能够抑制其他Pseudomonas菌株的生长,这种抑制既依赖于 Tse2的作用,又依赖于细胞和细胞之间的联系,由此为效应子运输到靶定细胞中提供了强有力的证据[32]。

3.2 Ⅵ型分泌系统的作用机制

T6SS含有一个来自于AAA+(ATPases associate with various cellular activities),ClpV家族的六聚物-ATPase,通过ATPase的水解作用供能,来完成泌出蛋白的运输过程。其中,ClpV是H sp100/C lp家族的成员。Hsp100/Clp蛋白具有多聚环状的结构,能够通过保守的AAA结构域结合ATP并且能够将A TP水解来展开靶标蛋白。T2SS,T3SS和T4SS的 ATPase组分也形成六聚环,并且与AAA+蛋白具有一致性,由此说明这些ATPase在蛋白分泌中具有保守的结构特点[33-34]。伤寒沙门菌InvC,T3SS的核心ATPase负责展开来自分子伴侣的分泌蛋白,并可能将这些底物泵入 T3SS针状结构中(折叠的蛋白不能进入针状结构,只有展开后才可进入)[35]。ClpV对于分泌蛋白H cp和VgrG则没有显示出相同的作用,而是与T6SS组分中的2个至关重要和相对保守的蛋白V ipA和V ipB相互作用[36]。

综合已有研究报道,通过生物信息学分析,T6SS的作用机制假说可以归结为：T6SS系统最初的活化依靠未知的环境因子。在细菌感应到信号后,具有FHA结构域的Fha同系物通过与丝氨酸-苏氨酸激酶相互作用引发了最初的活化。一旦被激活,T6SS设备的组装开始,泌出通道由 H cp、VCA 0109和VgrG形成。当H cp在跨膜区域形成一个六聚体泌出通道后,VgrG便在细胞表面形成一个可以到达寄主细胞的尾突状结构,它作为穿刺设备起作用。VCA 0109从细菌的外膜到寄主膜形成一个通道并且与VgrG的每个单体的gp5结构域相互作用。所有内膜蛋白的组装机制目前尚不清楚。在组装好所有组分后,作为分子伴侣和ATPase的ClpB,形成一个六聚结构,该结构与Hcp相互作用,通过水解ATP为效应子蛋白的运输提供能量。辅助蛋白VasK和VasF(IcMF蛋白家族)引起细菌细胞表面的重组,导致了对寄主细胞黏附度的增加。VasK同时帮助运输和信号识别作用,因此可以增加运输的效率。效应子蛋白(H cp,VgrG等)在脂蛋白VCA 0113的帮助下,通过由OMpA形成的易位孔运输至胞外。其中,VCA 0109,属于溶菌酶家族蛋白,包含一个gp25结构域,该结构域被认为用于水解寄主细胞壁的肽聚糖残基——NAG和NAM。VCA 0113是一个功能未知的蛋白,位于霍乱弧菌的T6SS基因簇,具有脂蛋白结构域,参与胞内蛋白的运输和泌出,VCA 0113是 T6SS中仅有的外膜蛋白[31]。

4 植物青枯菌Ⅵ型分泌系统的研究现状

植物细菌性青枯病是由茄劳尔氏菌(Ra lstonia solanacearum)引起的一种世界性分布的重大病害。2002法国科学家Salanoubat等在Nature上报道了青枯细菌(GMI 1000菌株,1号小种)的全基因组序列,是世界上报道的第1例植物病原细菌全基因组序列[37]。

目前有关茄劳尔氏菌(R.so lanacearum)中T6SS的研究文献较少,进展不大,因此对茄劳尔氏菌中T6SS的研究显得更有意义。

通过比对,我们发现公布的青枯菌基因组序列中也存在与Ⅵ型分泌系统同源的基因簇,同源性达到80%。我们对编码核心蛋白的8个基因进行了克隆,并完成了这8个基因的重组自杀质粒的构建,目前已获得了其中的2株单基因失活突变株。经致病性试验发现,这2株突变株的致病能力较野生型明显下降[38]。

目前的研究已经初步证明Ⅵ型分泌系统的基因簇与青枯菌致病有关[38],但还有待于更进一步的研究。由于Ⅵ型分泌系统是新近发现的分泌系统,其结构、功能及泌出蛋白的种类和机制尚不清楚。因此对青枯菌Ⅵ型分泌系统的研究,可能对探究其致病机理具有非常重要的意义。

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