乳白蛋白-油酸复合物抗癌活性研究进展

文 / 方 冰 郭慧媛 张 昊 任发政 中国农业大学教育部功能乳品重点实验室

1995年，Hakansson等人在研究母乳抗菌活性时意外发现，母乳中含有一种特异性诱导肿瘤细胞凋亡的物质，并且其分子量同乳白蛋白很相近，但单纯的乳白蛋白并不能引起肿瘤细胞的凋亡，故称这种诱导细胞凋亡的物质为乳白蛋白聚合物[1]。随后的几年，Svensson及Svanborg等人对这种聚合物的组成和结构进行了深入的研究，确定这种聚合物为乳白蛋白－油酸复合物（Human Alpha-Lactalbumin Made Lethal to Tumor Cells，HAMLET），并于2000年成功地在体外合成了这种诱导肿瘤细胞凋亡的物质[2]。近年来，针对HAMLET的研究已成为食品、医学以及分子生物学领域中的一个热点。本文将从HAMLET的结构、活性、作用途径及临床应用4 个方面展开论述。

1 HAMLET的结构

Α－乳白蛋白主要存在于哺乳动物的乳汁中，由122或123 个氨基酸组成，包含2 个结构域，即较大的α－折叠结构域和较小的β－折叠结构域。这2 个结构域由Ca2+和4 条二硫键稳定连接[3]。

乳白蛋白（Lactalbumin，LA）本身并没有诱导肿瘤细胞凋亡的活性，必须同油酸结合后才能具备凋亡活性。通过核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）、透射电镜及原子力显微镜观察HAMLET结构时发现，油酸不是单纯的与蛋白质的氨基酸侧链结合，而是被蛋白质包裹而形成胶囊状复合物[4]。LA的折叠核心位点在包含Ca2+结合位点的α－区域和β-区域的界面上[5]。由此可推测，油酸的结合区域很可能是在Ca2+结合区域。油酸的结合使得LA的结构发生了改变并在一定程度上稳定了HAMLET的构象。圆二色谱测定LA及HAMLET的二级结构时也发现，HAMLET中的α－螺旋结构要明显多于LA中的[5]。氨基酸末端序列测定及氢/氘离子交换NMR研究表明，油酸是通过与脱去Ca2+后伸展开的β-折叠区域结合，进而转化为α－螺旋[6]。

2003年，Svensson等人研究了不同碳链长度、不同饱和度、不同双键构型的16 种脂肪酸同LA结合形成HAMLET的能力[7]。结果表明，LA只能同油酸及其他十八碳饱和脂肪酸（如硬脂酸）、不饱和脂肪酸（如亚油酸）形成具有凋亡活性的复合物，其他较短碳链的饱和及不饱和脂肪酸、反式脂肪酸（包括十八碳）均不能同LA结合，表明脂肪酸同部分伸展的LA形成了特定的构型，从而使得这些复合物能够特异性杀死肿瘤细胞。

2 HAMLET的促肿瘤细胞凋亡活性

2.1 体外活性

在Hakansson等人首次发现乳白蛋白复合物能够促进肺癌细胞A549的凋亡之后，人们又研究了HAMLET对其他细胞的凋亡活性。迄今为止，已测定了来源于肺、喉、肾、结肠、膀胱、前列腺、卵巢、皮肤、淋巴等40 余种肿瘤细胞对HAMLET的敏感性[1，8]。所有检测结果皆表明，肿瘤细胞在HAMLET处理后发生了凋亡，尤其是淋巴类肿瘤细胞，对HAMLET的敏感性要高于其他实体瘤细胞。

2.2 体内活性

HAMLET在体外取得了良好的效果后，研究者开始关注HAMLET在体内的抗肿瘤活性。2004年，Fischer等人将人多形性胶质母细胞瘤细胞悬液注射到裸鼠大脑中，对造模成功的老鼠颅腔灌注HAMLET，并以LA作为对照。实验发现，注射LA的老鼠在8 周后出现颅腔压力升高等症状，而注射HAMLET的老鼠却无相应症状。NMR扫描脑部组织发现，对人神经胶质瘤模型鼠的脑腔灌注HAMLET可以显著减小脑瘤体积，并延长老鼠的生存时间，而LA却无此作用。同时对肿瘤组织进行凋亡检测发现，HAMLET可以诱导脑肿瘤细胞凋亡，而对周围健康脑细胞则无影响[9]。2009年，Mossberg等人对小鼠膀胱注射人膀胱癌细胞，造模成功后对膀胱组织灌注HAMLET和LA进行治疗。结果表明，灌注HAMLET组小鼠膀胱肿瘤体积明显缩小，凋亡检测也呈阳性结果。同时，该研究中将HAMLET和LA进行荧光标记，通过全身荧光检测发现，HAMLET仅分布于膀胱癌组织中，在肿瘤组织周围的正常组织中并无分布[10]。

3 HAMLET的作用途径

3.1 穿透细胞膜

HAMLET处理肿瘤细胞后会结合到细胞的表面并迅速进入细胞内，而LA及油酸本身均不具有进入细胞的能力。有学者利用荧光标记的HAMLET和LA处理小鼠淋巴癌细胞L1210，发现HAMLET和LA都可以吸附在细胞表面，但HAMLET却能够大量地进入L1210的细胞内[1]。荧光及NMR分析结果表明，乳白蛋白的α－螺旋保护了HAMLET中的抗肿瘤功能区[11]。肿瘤细胞丰富的细胞膜磷脂或存在于细胞膜外层的O型糖基化粘液素可能是HAMLET能高效结合肿瘤细胞膜并侵入肿瘤细胞的重要原因。

3.2 改变线粒体的形态功能

3.3 激活胞内蛋白酶

HAMLET除作用于肿瘤细胞的线粒体和细胞核外，还作用于细胞内的蛋白酶和泛素化蛋白酶体系统。侵入肿瘤细胞中的HAMLET可以同20S蛋白酶体结合，改变蛋白酶体的结构，从而激活细胞内蛋白酶而降解大量的细胞内蛋白质，即使随后去除进入细胞的HAMLET，蛋白酶仍能降解细胞内的蛋白质[13]。同时，用蛋白酶体类的酶，如胃蛋白酶、糜蛋白酶体以及细胞内提取的20S蛋白酶体作用于HAMLET和LA时发现，HAMLET耐蛋白酶酶解的能力远高于LA。由此可知，HAMLET这种稳定的构象同其活性密切相关。

3.4 结合细胞核内染色质

以半数致死量的HAMLET培养肿瘤细胞1 h，90%的HAMLET定位于细胞核内。入核的HAMLET以高亲和力结合组蛋白H3，以较低亲和力结合组蛋白H4和H2，破坏组蛋白在DNA上的沉积，最终以高亲和力结合染色质，使肿瘤细胞染色质形成非水溶性复合物，从而致基因转录停止，诱导细胞死亡[14，15]。故常在HAMLET处理死亡的肿瘤细胞内可以检测到DNA片段及与DNA损伤相关的Caspase－2[16]。

4 临床应用

HAMELT在临床治疗上的应用目前已在皮肤乳头状瘤及膀胱癌2 个方面得到验证。2003年，Gustafsson等人对40例皮肤乳头状瘤患者进行了HAMLET的治疗研究[17]，以安慰剂作为对照，给药3 周，1 个月后观察治疗结果。实验发现，HAMLET治疗组的患者1 个月后皮肤乳头状瘤体积平均缩小75%，而安慰剂组患者仅缩小15%～20%。于是，对之前给安慰剂的患者同样采用HAMLET治疗，1 个月后皮肤乳头状瘤体积缩小82%。同时，对所有接受过HAMLET治疗的患者进行为期2年的观察发现，这些患者的肿瘤并未复发，且未出现其他副作用。在后来膀胱癌的HAMLET治疗研究中[18]，对9 例患表浅性膀胱癌的患者每天进行5 次患处HAMLET滴注，给药10 天后对患者的膀胱组织进行内镜检查，发现有8 名患者的膀胱癌组织体积减小，膀胱癌细胞脱落。对病人体内残留的癌组织进行凋亡检测发现，这些组织的细胞都呈现出明显的凋亡特征，同时，也在尿液中检测出凋亡的膀胱癌细胞，而癌旁组织中的正常细胞未呈现任何凋亡特征。

5 结语

HAMLET是乳白蛋白同油酸结合的复合物，能特异性地进入肿瘤细胞，同时作用于线粒体、蛋白酶体和细胞核，诱导肿瘤细胞的凋亡。目前对HAMLET的形成、结构及活性机理已有较全面的了解，HAMLET类似物的制备方法及活性也正在研究中，这将为临床治疗肿瘤提供新的途径。■

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