宫颈癌组织中sFRP1和β-catenin的表达及其意义

张孝艳 乔玉环 王琳 郭瑞霞

郑州大学第一附属医院妇产科，河南 郑州 450052

宫颈癌是威胁女性健康的第二大妇科恶性肿瘤，并具有年轻化趋势。现已证实人乳头瘤病毒(human papillomavirus，HPV)感染是宫颈癌及癌前病变的重要致病因素，大部分感染者可自然消退，仅有少数感染的妇女最终发展为宫颈癌［1］，这表明HPV感染并不是导致宫颈癌发生的唯一因素。近年来，Wnt信号通路在肿瘤形成过程中的作用成为研究的热点。分泌型卷曲相关蛋白1(secreted frizzled related protein 1，sFRP1)是Wnt信号通路的负调控因子，对Wnt信号通路的传导具有重要的抑制作用。β-连环蛋白(β-catenin)作为Wnt信号传导途径的核心元件参与调节该通路。本研究通过检测sFRP1和β-catenin在宫颈癌组织、宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)及正常宫颈组织中的表达情况，探讨其在宫颈癌发生、发展中的作用及与宫颈癌预后的关系。

1 资料和方法

1.1 研究对象

收集郑州大学第一附属医院2001年—2005年病理科存档的宫颈石蜡标本128例，其中正常宫颈20例，CIN 30例，宫颈癌78例(均有确切随访资料)。宫颈癌组织学类型：鳞癌60例，腺癌18例；临床分期(FIGO，2000)：Ⅰ期34例，Ⅱ期31例，Ⅲ～Ⅳ期13例；病理学分级：G1～G254例，G324例；伴有淋巴结转移者21例。患者中位年龄41岁(25～65岁)，术前均未接受放化疗。所有标本均经病理学证实。

1.2 试剂和方法

兔抗人sFRP1抗体和兔抗人β-catenin抗体均购自北京雷根生物技术有限公司，免疫组化(SP法)试剂盒、二氨基联苯胺(DAB)显色剂及抗原修复液均由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。操作步骤严格按试剂盒说明书进行。用已知的sFRP1和β-catenin阳性切片作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定

1.3.1 sFRP1的判定［2］

sFRP1阳性反应定位于细胞膜和细胞质，呈棕黄色颗粒。光学显微镜下选取5个视野(×400)，每个视野计数100个细胞。阳性细胞≤2%记为0分，>2%～<20%为1分，20%～<50%为2分，≥50%为3分。按着色深浅记分，无着色为0分，浅着色为1分，深着色为2分。上述两项分值相加为着色强度积分值：<2分为阴性(-)，2～<3分为弱阳性(+)，3～<4分为阳性(++)，≥4分为强阳性(+++)。

1.3.2 β-catenin的判定［3］

β-catenin正常染色定位于细胞膜。光学显微镜下选取5个视野(×400)，每个视野计数100个细胞。阳性细胞<25%记为0分，25%～<50% 为1分，50%～<75% 为2分，≥75%为 3分。按染色强度：无染色0分，淡黄染色1分，深黄色2分，棕褐色3分。取两者之和：0分为阴性(-)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，5分及5分以上为强阳性(+++)。其中>10%细胞质和(或)细胞核出现β-catenin表达为异位表达，阴性(-)、弱阳性(+)和异位表达皆为异常表达，阳性(++)、强阳性(+++)为正常表达。

1.4 统计学处理

所有数据用SPSS 16.0软件包进行处理。率的比较采用χ2检验，相关性检验采用Spearman等级相关分析，生存率采用Kaplan-Meier和logrank分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 sFRP1的表达及其与宫颈癌临床病理特征的关系

20例正常宫颈 上皮组织sFRP1染色均呈阳性，阳性率为100.0%(图1A)。30例CIN组织中sFRP1阳性率为70.0%(21/30)，呈弱表达(图1B)。78例宫颈癌组织中sFRP1阳性率为33.3%(26/78)，呈微弱表达(图1C、D)。3组比较差异有统计学意义(χ2=33.26，P<0.05)。

宫颈癌组织中临床Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ～Ⅳ期sFRP1表达阳性率分别为50%、25.8%和7.7%，差异有统计学意义(χ2=8.89，P<0.05)，其中Ⅰ期的表达率明显高于Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期(P<0.05)；有淋巴结转移组显著高于无淋巴结转移组(66.7%vs 28.1%，P<0.05)；sFRP1的表达与宫颈癌的病理学分级和组织学类型均无关(P>0.05，表1)。

2.2 β-catenin的表达及其与宫颈癌临床病理特征的关系

正常宫颈上皮β-catenin主要表达于细胞膜上，呈棕褐色细小颗粒状，仅1例同时出现细胞质阳性着色，细胞核无着色。在CIN及宫颈癌组织中，β-catenin呈明显的异常表达，表现为细胞膜表达减弱或消失，细胞质和(或)细胞核出现明显的着色(图2)。β-catenin在正常宫颈、CIN及宫颈癌组织中的异常表达率分别为5%(1/20)、43.3%(13/30)、70.5%(55/78)，差异有统计学意义(χ2=29.56，P<0.05)。

宫颈癌组织中临床Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ～Ⅳ期β-catenin异常表达率分别为52.9%、80.6%和92.3%，差异有统计学意义(χ2=9.55，P<0.05)，其中Ⅰ期的异常表达率显著低于Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期(P<0.05)；β-catenin异常表达强度在病理学分级G1～G2与G3之间的差异有统计学意义(P<0.05)；β-catenin异常表达强度在有淋巴结转移和无淋巴结转移的患者中，差异有统计学意义(P<0.05)；β-catenin异常表达与宫颈癌的组织学类型无关(P>0.05)。

图1 sFRP1在各组织中的表达Fig.1 The expression of sFRP1 in different tissues(SP, ×400)

图2 β-catenin在各组中的表达Fig.2 The expression of β-catenin in different tissues(SP, ×400)

表1 sFRP1与β-catenin的表达与宫颈癌临床病理特征的关系Tab.1 The relationship between expressions of sFRP1 and β-catenin and clinicopathological characteristics in cervical cancer

2.3 宫颈癌组织中sFRP1表达与β-catenin表达的相关性

34.6%的sFRP1阳性表达宫颈癌患者中β-catenin呈现异常表达，而sFRP1阴性表达的宫颈癌患者中β-catenin的异常表达率达88.5%，差异有显著的统计学意义(P<0.001)。宫颈癌组织中sFRP1阳性表达与β-catenin的异常表达呈负相关(r=-0.557，P<0.001)。

2.4 sFRP1、β-catenin表达与宫颈癌预后的关系

在78例宫颈癌患者中，sFRP1阳性表达26例，阴性表达52例，sFRP1阳性表达者5年生存率高于阴性表达者(79.8% vs 60.5%，P<0.05)。β-catenin正常表达23例，异常表达55例，正常表达者5年生存率显著高于异常表达者(83.7%vs 59.2%，P<0.05)。

3 讨 论

sFRP1在胚胎发育阶段参与眼、脑及血管系统的形成和细胞分化，在成体中主要表达于脑脉络膜、视网膜、晶状体、睫状体及血管内皮等组织，参与这些组织的代谢［4］。sFRP1作为W nt信号上游抑制因子，含有一个CRD(半胱氨酸富含域)结构域，其部分氨基端序列与Wnt蛋白受体即卷曲蛋白(frizzled，Frz)结构类似，通过与Frz竞争结合Wnt蛋白或与Frz结合成无功能的复合体发挥抑制Wnt信号通路的作用，在抗肿瘤及促细胞凋亡等生物过程中起到了一定的作用［5］。Chunga等［6］研究证实了sFRP1在宫颈癌细胞中是一种抑癌基因，sFRP1的表观遗传学沉默激活了Wnt经典通路的原癌基因，并且通过转染技术使sFRP1重新表达后，能够有效抑制宫颈癌CaSki细胞的增殖、转移及侵袭。有研究表明，sFRP1在多种人类实体肿瘤中存在表达缺失，如结直肠癌、乳腺癌及肾细胞癌等［7-9］。

本研究结果发现，随着病变程度的加深，sFRP1的表达呈下降趋势，在正常宫颈上皮组织、CIN和宫颈癌组织中的阳性率分别为100.0%、70.0%和33.3%，差异具有统计学意义(P<0.05)，表明从癌前病变发展到浸润癌的过程中sFRP1可能起了重要作用。宫颈癌临床Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ～Ⅳ期sFRP1阳性表达率也呈现逐渐下降趋势，分别为50.0%、25.8%和7.7%，其中Ⅰ期的阳性表达率明显高于Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期(P均<0.05)，且有淋巴结转移者显著高于无淋巴结转移者(P<0.05)，提示sFRP1的表达可能与宫颈癌细胞的侵袭及转移有关。

β-catenin是连环蛋白家族中一员，具有介导细胞黏附及信号转导的双重功能。β-catenin在细胞质内以两种形式存在：一种为结合型，与E-cadherin结合参与调节同种细胞间的黏附；一种为游离型，参与Wnt信号传导途径。游离的β-catenin可通过核膜进入到细胞核内，与转录因子Tcf/Lef结合，激活Wnt途径靶基因，如c-myc、cyclin D1，调节细胞的增殖，参与肿瘤形成［10］。

Nakopoulou等［11］通过检测141例乳腺癌标本中β-catenin的表达，结果发现细胞核内β-catenin高表达与乳腺癌的侵袭性及不良预后有关。Wanitsuwan等［12］对163例结直肠癌研究发现，β-catenin的细胞核异常表达率高达81.4%，并与肿瘤的临床分期及淋巴结转移有关。Sangkhathat等［13］通过在肝癌细胞内转染siRNAs引起细胞内β-catenin表达下降，从而达到抑制肝癌细胞增生的作用。Chunga等［6］在宫颈癌CaSki细胞质及细胞核中发现有β-catenin的异常聚集。

本研究结果表明，从正常宫颈组织发展为CIN再演变为宫颈癌，β-catenin的异常表达逐渐增强，且宫颈癌组明显高于其他两组，提示β-catenin的异常积聚可能在宫颈上皮癌变过程中起重要作用。随着Wnt信号通路拮抗剂sFRP1在宫颈癌组织中表达的逐渐减弱，β-catenin的异常表达程度呈逐渐增高趋势。表明sFRP1的低表达可能是导致β-catenin正常表达下降、异常表达升高的因素之一，并且sFRP1与β-catenin的作用不是独立的，而是共同作用促进宫颈癌的发生、发展、侵袭及转移。

本研究结果还证实，sFRP1、β-catenin的表达与宫颈癌的预后有关，可作为预测宫颈癌预后的指标之一。

综上所述，在宫颈癌组织中Wnt信号传导通路抑制蛋白sFRP1呈明显的表达减弱或缺失，β-catenin的细胞膜表达减弱，细胞质及细胞核的异常积聚增加，表明Wnt传导通路在宫颈癌中处于激活状态，提示该传导通路与宫颈癌的发生、发展密切相关。信号抑制蛋白sFRP1的表达减弱可能是导致β-catenin在细胞质和细胞核内积聚以及Wnt信号活化的原因之一，并且sFRP1和β-catenin有望成为预测宫颈癌预后的指标及生物靶向治疗的靶点。

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