发酵液中替考拉宁含量的HPLC法测定

张波

替考拉宁(Teicoplanin)为新型糖肽类抗生素，抗菌谱及抗菌活性与万古霉素相似，对金黄色葡萄球菌的作用比万古霉素更强，不良反应更少。本品对革兰阳性菌如葡萄球菌、链球菌、肠球菌和大多厌氧性革兰阳性菌敏感，具有较强的杀菌活性。由于替考拉宁独特的作用机制，很少出现耐替考拉宁的菌株，所以对青霉素类及头孢菌素类，大环内酯类、四环素类和氯霉素类，氨基糖苷类和利福平耐药的革兰阳性菌，仍对替考拉宁敏感［1，2］。本文采用高效液相色谱法，乙腈-磷酸盐体系作为流动相，对发酵液中的替考拉宁含量测定方法进行研究，结果满意。

1 仪器与试剂

Waters1525型液相色谱仪(美国Waters公司)，UV100型紫外检测器，替考拉宁对照品(中国药品生物制品检定所提供)，替考拉宁样品(山东鲁抗医药股份有限公司);乙腈(色谱纯，天津四友公司)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为磷酸盐缓冲液(pH=6.0)-乙腈(75∶25)，流速1.0 ml/min，检测波长为 254 nm，进样量 10 μl。

2.2 检测波长的选择 对替考拉宁对照品的流动相溶液进行紫外扫描，结果在254 nm附近有较大吸收，在此波长处发酵液无明显干扰，故选择254 nm作为检测波长。

2.3 标准溶液的配制 精密称取替考拉宁对照品约20 mg，置10 ml容量瓶中，振摇，用流动相溶解至刻度，作为供试品溶液，另取替考拉宁样品适量，同法操作。

2.4 系统适用性试验 取10 μl对照品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。在该色谱条件下，替考拉宁峰与其他杂质峰分离度大于1.2。

2.5 破坏性试验 称取替考拉宁对照品各约200 mg，分别置于3个100 ml容量瓶中，分别加入1 mol/L盐酸、1 mol/L氢氧化钠，3%的过氧化氢溶液各10 ml，于室温放置1 h，用流动相定容，作为破坏后的供试品溶液，分别取10 μl注入液相色谱仪，结果替考拉宁与杂质分离良好。

2.6 线性关系 精密称取替考拉宁对照品适量，分别制成每1 ml中含替考拉宁 500.0，1000.0，2000.0，3000.0，4000.0，5000.0 μg的溶液，注入液相色谱仪，以替考拉宁峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标，计算得回归方程为:

A=487939 C，r=0.9988

2.7 最低检测限 采用逐级稀释法，以S/N≥3为最低检出限，测得最低检测限为4.50ng。

2.8 精密度试验 试验按2.3项下配制的2000 μg/ml的溶液，连续进样6次，计算其RSD为0.55%。

2.9 加样回收率试验 取已知含量的替考拉宁样品，制成2.3项下浓度的替考拉宁供试品溶液，共6份，分别精密加入含已知量的对照品溶液，摇匀，取10 μl进样，结果替考拉宁的平均回收率为100.2%(RSD=0.14%，n=6)。结果见表1

2.10 发酵液中样品测定 取约20 ml发酵液用2 mol/L氢氧化钠调 pH=11，搅拌10 min，在3000转/min下离心10 min，取上清液，以2 mol/L盐酸调pH至8.5，取调后上清液，过滤。取稀释配制成约2000 μg/ml的溶液，摇匀，过滤，取10 μl进样，结果在此色谱条件下，发酵液中杂质对主峰无干扰，分析重复性及精密度结果较满意。

表1 加标回收率试验结果

3 讨论

本文采用乙腈-磷酸盐体系作为流动相对替考拉宁进行样品测定，精密度好，色谱峰对称性也较好，同时我们还对样品溶液经过不同时间的放置来检验样品在溶液中的稳定性，发现样品在本流动相溶液中相当稳定，适宜于成品的检测和发酵液中间体的质量控制。

［1］夏振强，古勇，官家发.糖肽类抗生素替考拉宁研究进展.天然产物研究与开发，2005，18(2):236-238.

［2］何礼贤，潘珏，陈世耀，等.替考拉宁治疗革兰阳性球菌感染的临床研究.中华内科杂志，2005，33(5):532-533.