国产与进口Y染色体微缺失筛查试剂的评估性研究

朱晓红 王晓梅 张艳萍 王 毅 马 旭

国家人口计生委科学技术研究所(北京，100081)

Y染色体无精子因子(AZF)微缺失是导致生精障碍的主要遗传学原因之一［1］，常见于不育症患者［2］。Y染色体微缺失筛查有预测价值并可影响临床治疗措施的选择，因此目前临床分子遗传学科室已逐步开展染色体微缺失检测工作。检测基因缺失最常见的方法为聚合酶链反应(PCR)扩增技术，对于目的位点扩增结果呈阴性的样品除重复检测以外，一般还需要用Southern杂交进行确认。因而基于多重PCR的技术仅仅可以作为基因缺失的筛查技术，而筛查还需要考虑操作的简便性和筛查成本。为此，本研究比较了进口20个序列标签位点(STS)与国产15个STSY染色体AZF 微缺失筛查试剂的稳定性、重复性和有效性，为临床分子遗传实验室开展相关工作提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象

46例无精(43例)、少精症(3例)患者来自国家人口计生委科学技术研究所门诊，所有患者均结婚2年以上。精液分析及无精症、少精症诊断按世界卫生组织(WHO)推荐方法和诊断标准［3］进行，即连续2次精液检查分析并经离心沉淀均无精子者为无精症，精子密度＜5×106/ml者为少精症。另外选择2例已正常生育的男性为对照，2例正常生育女性为阴性对照，纯水作为空白对照。

1.2 Y染色体AZF微缺失检测

1.2.1 DNA提取采集外周血3ml，EDTA抗凝。按照血液基因组DNA提取试剂盒(购自北京天根生化科技公司)说明进行DNA提取，－20℃保存。

1.2.2 20个STSAZF微缺失检测Y染色体微缺失检测试剂盒购自美国PROMEGA公司(Ca#MD1531 Lot#290463)，根据欧洲男科协会(EAA)和欧洲分子遗传实验预控网(EMQN)检测指南推荐的方法，应用多重PCR技术进行检测。扩增体系采用位于Y染色体的SMCX基因和ZFX/ZFY基因为PCR扩增内对照。20个STS在Y染色体上的位置和扩增体系组合见表1。反应条件为:基因组DNA 2μl，引物混合液20μl，金牌 Taq 酶 0.5μl，纯水 2.5μl，体系为 25μl。扩增条件为:94℃ 2min，94℃ 1min，57℃ 30s，72℃1min，35个循环，最后72℃延伸5min。取PCR产物8μl加2μl 6×上样缓冲液，充分混合均匀后经4.0%琼脂糖凝胶电泳(恒压120V)40min，用培清 JS－680B全自动凝胶成像分析系统(上海培清科技有限公司)进行DNA电泳条带观察。

表1 Y染色体微缺失检测20个STS的遗传和多重PCR分组信息

1.2.3 15个STSAZF微缺失检测Y染色体微缺失检测试剂盒购自深圳亚能公司(20110401)，根据EMQN检测指南推荐的方法采用多重PCR技术进行检测。扩增体系采用位于Y染色体的ZFX/ZFY基因为PCR扩增内对照。15个STS的遗传和多重PCR分组见表2。反应条件为:基因组 DNA 2μl，纯水9μl，引物混合液 9μl，体系为 20μl。扩增条件为:95℃ 3min，95℃ 30s，59℃ 30s，72℃ 30s，35 个循环，最后72℃延伸10min。取PCR产物8μl加2μl 6×上样缓冲液，充分混合均匀后经4.0%琼脂糖凝胶电泳(恒压120V)40min，用培清JS－680B全自动凝胶成像分析系统进行DNA电泳条带的观察。

表2 Y染色体微缺失检测15个STS的遗传和多重PCR分组信息

2 结果

2.1 Y染色体AZF缺失检测

46例无精、少精患者中共发现Y染色体AZF微缺失9例，均为无精症患者，总缺失率为19.57%(9/46)。AZFa、AZFb、AZFc和 AZFd四个区域的缺失构成比分别是 22.22%、37.5%、88.89% 和 88.89%。其中，AZFa单独缺失1例、AZFc+d联合缺失5例、AZFb+c+d联合缺失2例，AZFa+b+c+d 1例。

图1 无精症和少精症患者AZF缺失电泳图举例

2.2 商品化试剂的评价

2.2.1 20STS和15STS检测试剂敏感性比较20STS复合扩增体系的推荐DNA用量为50ng/PCR反应，即5个复合扩增体系的DNA用量为250ng;15STS推荐DNA用量为200～400ng/PCR反应，4个复合扩增体系的DNA用量为800ng。在实际检测过程中，20STS与15 STS均使用相同的DNA用量，即2μl/反应，约为100ng/反应，如图1所示泳道1～4、6～9是20STS扩增产物，泳道11～14是15STS扩增产物，上述DNA用量均满足两者扩增反应的要求，15STS扩增系统具有略高的敏感度。

图2 20STS和15STS检测灵敏度对比

2.2.2 20STS和15STS检测试剂的稳定性比较

20STS复合扩增体系的推荐使用时间是2年，15STS推荐使用时间为6个月，保存条件均为－20℃。在本次检测过程中，20STS与15STS均在有效期，阳性对照品扩增结果良好。20STS试剂在本实验室包藏期超过1年，大于15STS检测试剂的推荐有效期。

2.2.3 20STS与15STS检测结果的一致性比较

46例无精、少精症患者中，45例行Y染色体AZF微缺失检测20STS与15STS结果一致。在YD－9个体中，AZFd区域SY145位点20STS未检测到缺失而15STS检测到缺失，但在AZFd区域的SY152位点20STS和15STS均检测到缺失。

3 讨论

Y染色体长臂AZF微缺失被认为是引起男性生精障碍的常见的遗传病因。微缺失的发生是大的重复序列同源重组造成［4］，因此细胞遗传学和Y染色体AZF微缺失分析对辅助生育具有指导意义。目前，部分研究或临床采用6STS进行Y染色体长臂AZF微缺失的检测［5］，获得AZF微缺失的频率较低。采用数目较少的检测体系可能减少基因缺失者的检出，故建议选择多基因座系统检测试剂完成Y染色体AZF微缺失筛查工作。

本文系统比较了20STS和15STS的检测结果，46例无精、少精症患者中有45例行Y染色体AZF微缺失检测20STS与15STS结果一致。在YD－9个体中，AZFd区域SY145位点20STS未检测到缺失而15STS检测到缺失，但同在AZFd区域的SY152位点检测到缺失，故考虑结果判定一致。推测造成此现象的原因可能由于20STS与15STS中SY145基因座所选择的引物位置不同，两者的产物长度一个为143bp，另一产物长140bp。由于个体在引物结合区的微小变异可能造成扩增产物的丢失，而非实际DNA序列的缺失，故不同的扩增试剂可能造成Y缺失检测时个别基因座的假阴性或假阳性。

本研究严格依照EMQN检测指南中阐述的质量控制完成实验，研究结果表明国产试剂与进口试剂具有相同的检测稳定性、重复性和有效性，故考虑国产试剂具有较高的性价比。

1 李座祥，王琳，唐文豪，等.Y染色体无精子症因子区及男性不育相关基因研究进展［J］.生殖医学杂志，2005，14(3):176－81.

2 Simoni M，Bakker E，Krausz C，et al.EAA/EMQN best practice guidelines for molecular diagnosis of y － chromosomal microdeletions.State of the art 2004［J］.International Journal of Andrology，2004，27:240－249.

3 World Health Organization.WHO laboratory manual for the examination human semen and sperm －cervical mucus interaction［M］.5th ed.London:London Cambridge University Press，2009:4－33.

4 Ferlin A，Moro E，Rossi A，et al.The human Y chromosome’s azoospermia factor b(AZFb)region:sequence，structure，and deletion analysis in infertile men［J］.J Med Genet，2003，40(1):18 －24.

5 Mitra A，Dada R，Kumar R，et al.Screening for Y－chromosome micro－deletions infertile Indian males:Utility of simplified multiplex PCR［J］.Indian J Med Res，2008，127(2):124 －132.