母胎界面MCP－1表达异常与不明原因早期复发性流产的关系

张 钰 李俊霞 顾 艳 李 奕

天津医科大学第二医院计划生育科(300211)

早期复发性流产(ERSA)发病率为3% ～5%。排除临床上可明确的病因(染色体、解剖、内分泌及感染因素)，仍有近1/2的ERSA病因未明，称不明原因早期复发性流产(UERSA)。随着生殖免疫学的发展，逐步认识到UERSA是一种同种免疫病，其发病可能是由于母胎界面种植部位局部细胞功能的异常和细胞因子的分泌异常［1］，但导致UERSA的具体发病机制尚不完全清楚。单核细胞趋化蛋白 －1(MCP－1)是在体外最早发现的具有趋化活性的细胞因子之一，属于趋化因子家族。文献已证实早孕绒毛和蜕膜组织中均有MCP－1的表达，母胎界面产生的MCP－1与蜕膜局部的单核巨噬细胞的募集与激活有关［2，3］，但其与UERSA发病的研究尚未见报道。本研究通过筛选UERSA患者，采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT－PCR)和酶联免疫吸附测定(ELISA)方法，研究UERSA患者绒毛和蜕膜组织中MCP－1 mRNA的表达异常及血清MCP－1的蛋白含量与UERSA发病的相关性，为临床建立有效的监测指标和成功的治疗方案提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 对象

在知情同意下，选择2008年6月～2009年6月在天津医科大学第二医院计划生育科就诊的UERSA患者30例(UERSA组)，超声检查提示胚胎发育停止或孕卵枯萎，无胎心搏动。UERSA患者应符合以下诊断标准［4］:①与同一性伴侣连续发生至少2次自然流产，流产孕周为7～12周;②夫妇外周血染色体核型均正常;③生殖器官解剖结构未见异常;④内分泌激素(如性激素、血糖、胰岛素水平和甲状腺功能)均正常;⑤血清TORCH－IgM检测阴性，宫颈分泌物衣原体、解脲支原体检测均为阴性;⑥自身抗体阴性(外周血抗心磷脂抗体阴性，抗β2－糖蛋白1抗体阴性，狼疮抗凝物阴性)。同期随机收集自愿要求终止妊娠的健康早孕妇女30例为对照组，无自然流产、死胎、死产等不良孕产史，孕周7～12周，B超提示胚胎发育正常，本次妊娠期间无阴道流血、腹痛等先兆流产的症状和体征，未放置宫内节育器。

1.2 方法

1.2.1 标本采集及处理所有受试对象完善血常规、心电图、白带常规等各项检查，未发现异常后行负压吸宫手术。手术前采集肘静脉血5ml，室温静置2h后，2 500r/min离心15min，取上清液放入冻存管，置于－80℃冰箱冻存待测。手术后，无菌条件下选取绒毛、蜕膜组织约0.3g，立刻用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的无菌磷酸盐缓冲液漂洗，置于冻存管封存，液氮保存。

1.2.2 实时荧光定量RT－PCR技术检测绒毛、蜕膜组织中MCP－1 mRNA的表达①主要试剂:RNAiso Plus、RT－PCR试剂盒、荧光染料SYBR Green购自大连宝生物工程有限公司。荧光定量PCR仪:LightCycler(Roche公司)。②引物的设计和合成:根据Gen-Bank所发布的基因序列，由天津六合通生物技术有限公司设计和合成。MCP－1上游引物序列:5'－CAATCAATGCCCCAGTCACC－3'，下游引物序列:5'－CCTGAACCCACTTCTGCTTG－3'。选择 β －actin为内参照基因，其上游引物序列:5'－GCAAAGACCTGTACGCCAAC－3'，下游引物序列5'－ACATCTGCTGGAAGGTGGAC－3'。③绒毛、蜕膜组织中MCP－1 mRNA的检测:提取绒毛、蜕膜组织总RNA，按RTPCR试剂盒说明进行逆转录，获得cDNA。实时荧光定量RT－PCR总反应体系为:cDNA模板1μl，上、下游引物各 0.3μl，SYBY Green 染料 10μl，用双蒸水补足至20μl。反应条件为:95℃预变性10s，95℃变性5s、60℃退火20s、72℃延伸10s，共40 个循环，并且做熔解曲线和扩增曲线分析。④数据分析:根据Livak和Schmittgen［5］设计的比较阈值法来测定目的基因的相对表达，目的基因的相对表达量=2－△△Ct。

1.2.3 血清MCP－1蛋白含量测定Human MCP－1 ELISA测定试剂盒由美国R＆D公司提供，严格按说明书操作。用Model 680酶标仪(Sanyo，Japan)在450nm波长依序测量各孔的OD值，制作标准曲线并计算出相应的MCP－1浓度。

1.2.4 统计学分析所得数据以±s的形式表示，应用统计软件SPSS 11.0分析处理，计量资料分析采用Student－t检验。

2 结果

2.1 两组妇女临床相关指标比较

UERSA组和正常早孕组的年龄、孕次、停经天数均无统计学差异(P＞0.05)，具有可比性。UERSA组因为胚胎停育，胎囊小于正常早孕组(＜0.05)。见表1。

2.2 早孕绒毛、蜕膜组织MCP－1mRNA的表达

本实验采用实时荧光定量RT－PCR技术，MCP－1基因的熔解曲线和扩增曲线见图1、2。熔解曲线提示本实验目的基因扩增的特异性较高，扩增曲线提示本实验扩增质量良好。实验结果表明正常早孕妇女和UERSA患者绒毛、蜕膜组织均可见MCP－1mRNA的表达，绒毛、蜕膜组织MCP－1与内参基因β－actin浓度比值分别为1.68 ±0.42，2.30 ±0.86，差异有统计学意义(P＜0.01)。

2.3 两组绒毛、蜕膜组织中MCP－1 mRNA的表达量和血清中MCP－1蛋白含量的比较

UERSA组绒毛和蜕膜组织中MCP－1 mRNA的表达量均显著高于正常早孕组(P＜0.01);UERSA组血清中MCP－1蛋白的含量显著高于正常早孕组(P ＜0.01)。见图3、4。

表1 两组研究对象一般情况比较(±s)

表1 两组研究对象一般情况比较(±s)

＊与UERSA组比较P＜0.05

组别 例数 年龄(岁) 孕次 停经天数 胎囊大小(mm)UERSA 组 30 28.42 ±4.55 3.94 ±0.56 75.23 ±6.05 34.34 ±6.95正常早孕组 30 27.63 ±4.16 3.06 ±0.85 72.46 ±6.53 48.41 ±3.30*

2.4 血清MCP－1蛋白含量与绒毛、蜕膜组织中MCP－1mRNA表达量的相关性

UERSA组和对照组血清中MCP－1蛋白含量与绒毛组织中MCP－1 mRNA的表达量之间呈正相关(r=0.595，P ＜0.05)，与蜕膜组织中 MCP－1mRNA的表达量之间也呈正相关(r=0.655，P＜0.05)，见图 5、6。

3 讨论

3.1 母胎界面MCP－1的表达与正常早期妊娠的维持

从免疫学角度而言，自然妊娠是一种特殊类型的“半同种异体移植”。胚胎种植的免疫过程受胚胎和母体两方面的共同调节，发生在母胎界面的免疫反应使胚胎能够成功侵入子宫内膜并使子宫内膜的血管发生重铸，从而使胚胎能够从母体得到良好的血液供养而发育成熟［6］。母胎界面的胎儿面主要由绒毛滋养细胞组成，母体－蜕膜面富集着母方来源的免疫活性细胞，由子宫自然杀伤细胞(uNK细胞)、巨噬细胞和T淋巴细胞组成。已有研究表明，母胎界面局部免疫活性细胞并非源于前体细胞在子宫内膜的自我更新，而是从外周血中被募集迁移而来的。趋化因子MCP－1在单核－巨噬细胞的迁移、募集和归巢中发挥决定性作用，参与胚胎种植阶段母胎界面的免疫反应［7，8］。本研究结果显示，在早孕绒毛和蜕膜组织中共表达MCP－1 mRNA，且在蜕膜的表达高于绒毛，提示MCP－1可能参与复杂的母胎界面的整合性调控，在蜕膜巨噬细胞的招募和迁移中发挥重要作用。推测胎盘绒毛和蜕膜组织可能通过自分泌和旁分泌MCP－1调节滋养细胞和蜕膜免疫活性细胞的功能，从而调节母胎免疫耐受，最终成功妊娠。

3.2 绒毛、蜕膜组织中MCP－1mRNA的表达与UERSA

目前认为巨噬细胞活性和功能的异常是导致母胎免疫耐受失衡、发生 UERSA 的重要原因［9，10］，病理机制可能是:①巨噬细胞被激活后，可造成肿瘤坏死因子(TNF)－α、白介素(IL)－1等炎症细胞因子水平升高，高浓度的炎症细胞因子可以通过多种途径导致流产［11］;②巨噬细胞激活后不能及时清除凋亡的滋养细胞，凋亡的滋养细胞蓄积，可引发针对胎儿抗原的免疫攻击;③巨噬细胞激活后可激发Thl型免疫反应，促使母体排斥胚胎组织［12］，最终导致自然流产的发生。体外试验研究发现滋养细胞与蜕膜接触时会诱导巨噬细胞大量分泌MCP－1，从而吸引外周血中的单核细胞和蜕膜组织中的巨噬细胞不断聚集在种植部位并激活，激活的巨噬细胞在滋养细胞的诱导下分泌诱导局部免疫抑制反应以及营养胚胎的细胞因子。如果提升蜕膜组织中MCP－1的浓度，会使巨噬细胞的招募变得不可抑制，而升高内膜中炎症细胞因子TNF－α、IL－1等的浓度，均可诱导MCP－1的表达，这将构成一个正反馈放大环路［13，14］。米亚英等［15］研究发现:自然流产小鼠模型蜕膜组织中MCP－1、TNF － α 的表达显著升高，Chaiworapongsa等［16］发现，羊水中MCP－1水平升高是自然流产的一个危险因素，这些研究均提示MCP－1的表达与自然流产的发生及发展密切相关。本研究发现UERSA组绒毛、蜕膜组织中MCP－1 mRNA表达量显著高于正常妊娠组，提示母胎界面MCP－1表达上调可能与UERSA的发病有关，MCP－1参与了自然流产过程。推测MCP－1可能是巨噬细胞参与母胎界面免疫反应的始动因素，母胎界面MCP－1表达上调，直接导致了巨噬细胞的数量和免疫活性异常，数量增多、功能增强的巨噬细胞再分泌大量的MCP－1，诱导更多巨噬细胞聚集，由此产生级联放大作用，发挥免疫效应，可能是最终导致胚胎死亡的重要机制。

3.3 血清MCP－1蛋白含量和绒毛、蜕膜组织中MCP－1－mRNA表达的相关性及意义

胚胎发育停止在临床上属于稽留流产的范畴，如不及时诊断、治疗，胚胎可发生机化，与子宫壁粘连，在清宫术中易导致子宫穿孔、吸宫不全、子宫出血、感染等严重的并发症，增加清宫手术的难度。目前对妊娠早期胚胎发育的监测主要通过超声检查和血清人绒毛膜促性腺激素(hCG)的测定来完成，B超下孕卵形态或位置的改变，胎心的消失，血hCG的明显降低都能较准确地指示流产的发生。然而B超和血hCG测定预测胚胎发育不良仍有一些不足之处，当患者停经天数较少、月经不规律、B超未见胚胎心管搏动时，仅凭B超检查无法确定胚胎发育情况，往往需连续观察数周。而血清hCG半衰期长，浓度变异范围较大，正常早期妊娠与稽留流产之间交叉部分较大，且单次测定可能存在误差，因此仅凭测定hCG也不足以诊断。故能否找到一些更有价值的指标来监测胚胎停育，为胚胎发育不良的早期发现、诊断和治疗提供帮助，成为众多学者广泛研究的问题。目前已有报道，某些细胞因子对自然流产、早产等不良妊娠结局有一定的预测作用［17，18］，但国内外关于此方面的研究颇少。如前所述，母胎界面MCP－1是绒毛和蜕膜组织共同分泌的，是妊娠早期成功种植胚胎和胎盘形成过程中重要的决定因素，与自然流产的发生密切相关。但直接进行绒毛和蜕膜活检检测MCP－1表达是侵入性方法，可能引起流产和胚胎损伤。本研究发现，UERSA组血清中MCP－1蛋白的含量高于正常早孕组，且血清中MCP－1含量与母胎界面MCP－1 mRNA表达水平有良好的相关性，提示可以通过检测孕母血清MCP－1的水平来反应母胎界面MCP－1 mRNA的表达水平。通过监测孕母血清MCP－1的水平评价胚胎发育情况，作为鉴别正常早期宫内妊娠和胚胎发育不良的诊断依据，对于早期诊断胚胎停育具有重要意义。

总之，通过上述研究提示母胎界面绒毛、蜕膜组织MCP－1高表达，可能导致蜕膜巨噬细胞数量和活性改变而直接影响母胎间的免疫平衡，最终导致UERSA的发生。这一结果将有利于深入探讨改变母胎界面MCP－1表达在UERSA治疗中的可行性。

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