酸解法-氨基酸分析仪测定蚕蛹中的17种氨基酸

雷萍林淼

蚕蛹(Silkworm pupa)为蚕蛾科家蚕Bombyx mori L的蛹，又名小蜂、蝶元、蚕女，是缫丝工业的主要副产物。蚕蛹营养价值极高，蛋白质占干蛹的45%～50%，脂肪占干蛹的25%～30%，其营养价值可以与进口优质鱼粉相媲美，价格却比鱼粉便宜60%，是一种优质饲料原料，可以作为蛋白质添加剂使用。蚕蛹蛋白质主要为优质球蛋白，含有人体必需的8种氨基酸占总氨基酸含量的40%，构成蛋白粉的氨基酸含量丰富且均衡，符合FAO/WHO模式，是一种比较理想的优质蛋白质，特别是赖氨酸的含量高于其他动物蛋白，是加工和精制高级食品的优质原料（周贞宾，2009；佳善，1996）。

但是蚕蛹具有易氧化变质的特点，加上目前蚕蛹分离蛋白制备及深加工的技术水平参次不齐，在以蚕蛹为原料，加工开发食品、副食品及医药用品时，必须对原料蛹或成品进行检测，以保证人们在使用时有益而无害。目前，只有少数几篇文献涉及到蚕蛹氨基酸含量的定量分析。而对于氨基酸的分析大多采用液相色谱（刘利娥等，2008）、气相色谱-质谱联用（张红漫等，2004；PerssonJ等，2001）、毛细管电泳（LinZ等，2008）、凯氏定氮法（罗钦等，2005）和光谱法（丁丽敏等，1999；Verma K 等，1988）等。然而，这些方法或试剂费用昂贵，或分离效率低，有些方法还不能同时测定多种氨基酸。运用氨基酸分析仪可解决上述问题，同时方法操作简便，重现性好，灵敏度高。

1 实验部分

1.1 方法原理

酸水解法是使用6 mol/l的盐酸作酸解剂，使蚕蛹蛋白在110℃，盐酸作用下，水解成氨基酸，再经离子交换柱分离后与茚三酮柱后衍生再进行紫外测定（Verma K等，1988）。17种重要氨基酸中，脯氨酸在570 nm处有最大吸收峰，除脯氨酸外其他各氨基酸均在440 nm有最大吸收峰。因此，在570 nm检测波长计算脯氨酸含量，而在440 nm检测波长计算其它各氨基酸含量。

1.2 试剂与材料

1.2.1 试剂

酸解剂：6 mol/l盐酸溶液（将优级纯盐酸与水等体积混合）；液氮或干冰-乙醇(丙酮)；茚三酮溶液；流动相：参照表1。

表1 流动相梯度洗脱

除特殊说明，所用试剂均为分析纯。实验用水为超纯水。

1.2.2 氨基酸混合标准储备液

含天冬氨酸、苏氨酸等17种常规蛋白水解液，分析用层析纯氨基酸，各组分浓度C(氨基酸)=100 nmol/ml。

1.3 仪器与设备

Amino A200自动氨基酸分析仪系统：配有微型光度检测器，超声波提取器，溶剂微孔过滤器带0.22 μm水相滤膜，涡旋振荡器，水浴锅，真空泵。

1.4 实验方法

1.4.1 试样制备

将蚕蛹烘干，在研钵中磨成粉状，称取0.5 g左右(精确至0.000 1 g)，置于20 ml浓缩瓶或浓缩管中，加10.00 ml酸解剂润湿后，置液氮或干冰(丙酮)中冷冻，然后，抽真空至7 Pa(≤5×10-2mm汞柱)后封口。放入（110±1）℃恒温干燥箱中，水解22～24 h。冷却，混匀，开管，过滤，用移液管吸取适量的滤液，置旋转蒸发器或浓缩器中，60℃抽真空，蒸发至干，必要时，加少许水，重复蒸干1～2次。用水将内容物定量地转移至50 ml容量瓶中，定容；过0.22 μm滤膜后即可上机。

1.4.2 色谱分析

色谱条件：氨基酸柱 (安米诺西斯公司生产)；柱温：采用程序升温，58 ℃(0～38 min)、70 ℃(38～43 min)、75℃(43～75 min)和 58℃(75～82 min)；流动相流速：0.2 ml/min；检测波长：440 nm/570 nm双波长同时检测；反应器温度：115℃；分别取标准溶液及试样20 μl进样。根据保留时间及标准加入法定性，试样峰面积与标准峰面积比较定量。

2 结果与讨论

2.1 氨基酸的色谱分析

实验所测定17种氨基酸标样色谱见图1。0～64 min图谱显示440 nm检测结果，64 min后显示第15～26 min波长570 nm检测结果。图1可见，17种氨基酸在选定的分离条件下可以达到很好的分离效果。

图1 氨基酸标准谱

2.2 精密度实验

在上述优化条件下，将浓度均为100 nmol/ml的氨基酸混合标准溶液连续进样9次，峰面积的相对标准偏差 (RSD)按出峰次序分别为3.1%(天冬氨酸)、2.9%(苏氨酸)、1.7%(丝氨酸)、2.8%(谷氨酸)、3.4%(脯氨酸)、2.7%(甘氨酸)、3.1%(丙氨酸)、3.3%(胱氨酸)、3.4%(缬氨酸)、4.0%(蛋氨酸)、2.9%(异亮氨酸)、2.8%(亮氨酸)、3.3%(酪氨酸)、1.9%(苯丙氨酸)、2.2%(组氨酸)、2.9%(赖氨酸)、2.5%(精氨酸)。实验结果表明，在上述优化条件下本实验方法是可行的。

2.3 方法的检出限、线性范围

根据以上的分离条件，对氨基酸的混合标样进行测定，以信噪比（S/N）为3时确定各种氨基酸的检出限；以几种浓度（2、5、10、20、50、100 μmol/l)氨基酸的混合标样进行测定，检测结果建立标准曲线并确定线性范围；在蚕蛹样品中添加氨基酸混合标样计算加标回收率。所得的数据见表2。由表2可以看出，该方法对17种氨基酸的检测具有较低的检出限、较宽的线性范围以及较高的回收率，说明了用该方法检测蚕蛹中的氨基酸所得到的数据是准确可靠的。

3 蚕蛹中氨基酸的测定

用所建立的方法对蚕蛹进行检测，所得到的典型样品图谱见图2，分析结果见表3。

表2 17种氨基酸的线性回归方程、相关系数、检出限及回收率

图2 蚕蛹中氨基酸标准谱

表3 蚕蛹中氨基酸的分析结果(n=3)

4 结论

氨基酸是蚕蛹的重要组成成分。长期以来，由于氨基酸的特殊性，其定量技术成为深入研究的难点。本研究采用氨基酸分析仪测定蚕蛹中氨基酸，利用不同氨基酸之间的阴离子交换色谱的保留行为存在差异，从而实现了分离。结果显示，所建立的方法具有较低的检出限、较宽的线性范围、简便、快捷、准确度高的特点。蚕蛹中的总氨基酸含量达到40%以上，表明这些蚕蛹具有良好的营养价值。

13篇，刊略，需者可函索）