地黄苏合香合剂对早期肝性脑病大鼠脑内外周型苯二氮受体的影响

刘赫，刘雁勇，杨楠，纪超，左萍萍，龚韬，廖磊，侯晓明，蔡哲

肝性脑病(hepatic encephalopathy,HE)是指发生于肝脏功能严重障碍引起的以代谢紊乱为基础的中枢神经系统功能失调综合征。发病初期以自主活动减少、定向力障碍为主；继而产生神经精神症状，如性格改变、行为异常等[1]。它是慢性肝病及严重肝病患者常见的并发症和死亡原因，病死率高达60%～80%，严重影响患者的生活质量，其发病机制目前尚未完全阐明。外周型苯二氮受体(peripheral-type benzodiazepine receptors,PBRs)与中枢γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)相关的苯二氮受体不同，位于星形胶质细胞的线粒体膜上。在肝硬化伴肝性脑病患者脑内PBRs增加，并有实验证明其增加可能是慢性高氨血症的结果[2]。PBRs的作用受到安定结合抑制剂(diazepam binding inhibitor,DBI)的调节，后者是星形胶质细胞中的一种内源性神经肽。DBI作用于PBRs后刺激神经激素产生，并能扩大GABA的作用。在肝性脑病的动物模型中，无论是DBI成分还是PBRs的密度均有增加[3]。本研究在前期工作的基础上，选择地黄和苏合香两味药组成的“地苏合剂”，采用四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)诱导大鼠早期肝性脑病模型，通过放射性配基受体结合实验，得到PBRs的动力学参数，以此探讨中药对化学性肝损伤诱导的肝性脑病早期的防治作用及其相关机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 SPF级雄性Wistar大鼠60只，由北京大学医学部提供，动物合格证号：SCXK(京)2007-0001。饲养条件：分笼饲养，每笼5只，自由饮食、饮水，自然昼夜节律光照，室温22℃～25℃，相对湿度40%～60%。在适应环境1周后随机分为对照组、模型组、阳性药组、低剂量组、中剂量组和高剂量组，每组6只。

1.2 药品、试剂与仪器 本实验采用的“地苏合剂”含地黄提取物(水苏糖含量49.88%，梓醇含量2.56%)及苏合香，均由北京市中药研究所中药化学室提供；乳果糖(杜秘克)：规格：15 ml/袋，含乳果糖10 g，苏威制药有限公司，批号：335202；CCl4：北京市化学试剂公司，批号：20090119，实验前用灭菌的橄榄油配成50%浓度。[3H]PK11195：放射性比活度83.5 Ci/mmol,PerkinElmer Life Science Co.,USA，非标记PK11195：Sigma Chemical Co.,USA，闪烁液以及1450LSC&液体闪烁技术仪：PerkinElmer Life Science Co.,USA。

1.3 实验方法

1.3.1 模型制备及给药 除对照组外，其余组采用经典的CCl4诱发肝纤维化模型，即灌胃给予50%CCl41 ml/kg，每周2次，连续造模12周[4]。在造模的同时，阳性药组给予乳果糖6 g/kg，低剂量组给予地黄提取物0.5 g/kg+苏合香0.008 g/kg，中剂量组给予地黄提取物1 g/kg+苏合香0.016 g/kg，高剂量组给予地黄提取物2 g/kg+苏合香0.032 g/kg。

1.3.2 皮层线粒体制备 造模12周结束后，每组取部分大鼠断头，迅速剥离颅骨，分离出皮层，每只大鼠取1/4脑皮层按1∶9的比例投入冰冷的pH 7.4匀浆缓冲液中冰浴电动匀浆。每组动物的匀浆液混合至一管，于4℃，700 g离心10 min。将上清液转移至干净离心管，4℃，16000 g离心10 min。收集沉淀，加入0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液8 ml重新悬浮沉淀，4℃，12000 g离心30 min，洗涤沉淀2次，收集沉淀物即线粒体。

1.3.3 放射配基受体结合饱和实验 取线粒体于4℃下解冻，加入预冷的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液电动匀浆，调整每管蛋白质浓度约为0.5～1.5 mg/ml。每管反应体系总体积均为 300μl，其中膜悬液 100μl。非特异结合管中加入100μl非标记PK11195。每管均加入0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液补足总反应体积。4℃孵育10 min 后，每管加入 10μl[3H]PK11195，在 0.1～3.5 nmol/L范围内设置7个浓度梯度。每个样本均为平行3管，4℃孵育1 h后，迅速真空抽滤到玻璃纤维素滤膜上，用20 ml预冷的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液重复洗涤滤膜两次终止反应。滤膜移至干净管中，加入2 ml甲苯闪烁液。暗适应至少8 h以减少化学发光，于液闪仪上测其每分钟计数值(counts per minute,cpm)值，每个标本计数30 s。为计算解离平衡常数(Kd)值和最大结合容量(Bmax)值，采用Scatchard方法作图进行直线回归，直线斜率为-1/Kd，横轴截距为Bmax。

2 结果

通过对大鼠进行行为学和血氨等指标的检测，可以判定早期肝性脑病模型成功建立[4]。

放射性配基受体结合实验中，大鼠脑皮层线粒体结合活性见表1。模型组大鼠脑皮层线粒体PBRs结合活性较对照组明显升高(P＜0.01)，阳性药组大鼠脑皮层线粒体PBRs结合活性较模型组明显降低(P＜0.01)，中、高剂量组大鼠脑皮层线粒体PBRs结合活性较模型组降低(P＜0.05)。

在受体饱和实验中，各组大鼠脑皮层线粒体PBRs Kd值无显著性学差异(P＞0.05)。模型组大鼠脑皮层线粒体PBRs的Bmax值较对照组明显升高(P＜0.01)，阳性药组和高剂量组大鼠Bmax值较模型组明显降低(P＜0.01)。见表2。

表1 各组大鼠脑皮层线粒体结合活性(fmol/mg prot.)

表2 各组大鼠脑皮层线粒体PBRs受体饱和实验

3 讨论

肝性脑病是各种急、慢性肝衰的神经精神系统并发症，症状多种多样，其发生的确切机制尚未完全明了，不过，氨中毒学说已被广泛接受。已有报道，在实验性急性肝衰竭中，氨刺激PBRsmRNA和PBRs结合位点表达增加。同样，暴露于氨或锰的星形胶质细胞PBRs结合位点表达也增加，提示血氨增高和(或)锰沉积可能是PBRs结合位点增加的原因[5-10]。PBRs激活后能诱导某些神经类固醇的合成[11]，神经性类固醇合成的增加在肝性脑病的发病机制中发挥重要作用。

中枢神经系统内的PBRs主要存在于外周及中枢神经系统所有组织的线粒体膜上[12]，并主要集中在线粒体内膜与外膜相接触的部位，即线粒体通透性转换孔[13]，参与调控神经类固醇的合成以及神经元的凋亡过程[14-17]。最近的研究表明，PBRs在各种中枢神经系统疾病，如神经变性、肿瘤、炎症、脱髓鞘、脑缺血、脑创伤、癫痫和肝性脑病中表达明显上调。因此PBRs已成为反映体内外神经病理学改变的一种敏感而特异的定量指标。深入研究其作用机制具有重要理论意义和实际意义。

线粒体PBRs具有广泛的生物学功能，它与激素产生的调控、细胞生长与分化的调节、凋亡的发生、线粒体膜电位的调控、线粒体呼吸功能的调节、免疫系统的反应、电压敏感型钙通道的调控、应激反应、小胶质细胞的激活、肿瘤细胞的分化均密切相关[18]。在体内，PBRs主要通过与其特异性配体结合而发挥多种生理功能。它可促进胆固醇跨膜转运进入磷脂膜，从而促进髓鞘形成；细胞因子通过刺激星形胶质细胞PBRs的表达来促进胶质瘢痕的形成，提示PBRs参与神经修复过程。PBRs表达增加能够很好地反映局灶性脑缺血半暗带以及损伤神经元通路顺行和逆行远隔区域小胶质细胞增生和活化。当持续异常的信号输入导致神经网络长期改变时，经突触传递的区域也出现胶质活化反应。因此，PBRs表达增加不仅是对组织损伤的反应，而且是对疾病的适应和神经网络重建过程的标志[19-20]。在线粒体PBRs的功能中，与甾体类激素合成的关系是最为人们所熟识的，胆固醇从线粒体膜外转运至膜内的过程决定着类固醇和胆汁酸的合成速度[21]。

当前，放射性配基受体结合分析法仍然是神经科学研究中的重要手段之一[22-23]。我们采用与PBRs具有高特异拮抗活性的[3H]PK11195配体进行受体饱和实验并做Scatchard曲线分析。结果显示，模型组大鼠脑皮层线粒体PBRs结合活性和代表受体数量的Bmax值较对照组均明显升高，地苏合剂中、高剂量组结合活性较模型组降低，高剂量组大鼠Bmax值较模型组明显降低。Bmax值越大，受体数量或密度越大。本实验证实，肝性脑病大鼠脑皮层PBRs可能存在着受体表达数量增加，表明[3H]PK11195结合量升高可作为神经损伤的一种标志，并可能成为用以解释药物作用的新靶点[24-25]。

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