γ射线对舞毒蛾虫卵处理效果的研究

李景奎，戚大伟，周志强，林海峰

（东北林业大学理学院，哈尔滨 150040）

舞毒蛾（Lymantria dispar）是一种世界性害虫，它具有分布广、食性杂、危害重、幼虫随风迁移的特点，主要危害针阔叶树种和果树，严重影响树木的正常生长，给林业生产带来巨大经济损失[1-4]。传统的处理方法是化学方法，但化学农药大量使用严重污染了环境，破坏生态平衡，导致害虫产生了严重的抗药性。为了更有效地控制舞毒蛾的危害，保护森林生态环境，需要采用化学防治、生物防治、物理防治等多种综合防治措施[5]。其中，γ射线辐照灭虫就属于物理防治的一种，γ射线对生物有机体的作用可使其发生一系列的生物化学变化，这种变化直接影响生物有机体的新陈代谢和生命活动，当生物体内γ射线积累到一定剂量时，使机体遭到损伤直至死亡[6-8]。

台盼蓝是一种酸性活体染料，它的胶粒表面带有阴离子，能使具有阳离子的部分染色。正常的活细胞，细胞膜结构完整具有选择透过性能够排斥台盼蓝，使之不能够进入细胞内；死细胞或细胞膜不完整的细胞，胞膜的通透性增加，可被台盼蓝染成蓝色。因此，用台盼蓝染色后在显微镜下观察，死细胞染成蓝色，活细胞不着色[9]。本试验以林木害虫舞毒蛾虫卵为试验材料，用不同剂量的γ射线照射舞毒蛾虫卵，观察照射后虫卵孵化率的宏观变化情况和活体染色后虫卵细胞的微观变化情况，为物理灭虫效果的检验提供新的方法，对物理灭虫的研究和实际应用具有重要的意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验虫卵

8月下旬在东北林业大学校园内采集舞毒蛾卵块，此时虫卵已完成胚胎发育，卵内为处于滞育期的准备越冬的舞毒蛾幼虫，挑选饱满、圆润舞毒蛾卵块放置在4℃冰箱中。

1.1.2 试验试剂

2%～3%福尔马林溶液，0.1 mol·L-1（pH 7.0）PBS缓冲液（配置方法：A液：2.76 g NaH2PO4·H2O，加蒸馏水至100 mL。B液：5.36 g Na2HPO4·7H2O，加蒸馏水至100 mL。取16.5 mL A液，33.5 mL B液，8.5 g NaCl用蒸馏水稀释至100 mL），1%台盼蓝（配置方法：将台盼蓝溶于生理盐水，配成0.5%～1%溶液，调pH到7.0～7.2），0.25%胰蛋白酶（配置方法：0.25 g胰蛋白酶粉，加D-Hanks液100 mL完全溶解，过滤除菌，调pH到7.4，密封，4℃保存），D-Hanks液（配置方法：8 g NaCl，0.40 g KCl，0.06 g Na2HPO4·H2O，0.06 g KH2PO4，0.35 g NaHCO3，0.02 g酚红以上成分依次溶于500 mL三蒸水中，完全溶解后，补足三蒸水至1 000 mL）。

1.1.3 试验仪器

同中心回转式60Co治疗机（FCC-7 000型，辐照剂量率为1.615 cGy·s-1，山东新华医疗器械股份有限公司出产），恒温水浴箱，普通显微镜，解剖镜，染色缸，吸管，脱脂棉，培养皿，滤纸，烧杯，载玻片，盖玻片等。

1.2 方法

1.2.1 试验前期处理

将虫卵用手轻轻揉搓，使之分成小颗粒的卵（不要揉碎卵粒），用吹风机使碎末和不成熟的虫卵与成熟虫卵分离。并用适量蒸馏水清洗，将洗净后的虫卵放在2%～3%的福尔马林溶液中进行消毒处理6～10 min后，再用蒸馏水清洗3遍，洗掉残余的福尔马林溶液。在干净的培养皿中放入一层脱脂棉，滴入少量的蒸馏水，并在上面盖一层滤纸，最后将清洗好的虫卵放在培养皿中。辐照试验分为宏观试验和微观试验两部分，宏观试验研究不同剂量的γ射线照射对舞毒蛾孵化率的影响，根据试验需要把培养皿分成五个辐照组和一个标准组，每组舞毒蛾卵粒为400只，在培养皿上分别贴上标签，标签分别为γ1、γ2、γ3、γ4、γ5，试验采用哈尔滨市第一医院放射科60Co源辐照舞毒蛾虫卵，辐照剂量分别为100、300、400、500和700 Gy，每组辐照试验重复3次，将辐照后的虫卵进行孵化，记录各组平均孵化虫卵数目，最终得到孵化率的平均值，具体的辐照参数设定与顺序排列如表1所示，标准组的虫卵没有经过任何电磁波照射，在室温的条件下自然孵化，用来作为试验参照标准[10-11]；微观试验是利用台盼蓝染色舞毒蛾虫卵细胞，研究虫卵细胞的微观变化情况，具体辐照参数设定与宏观试验相同。

1.2.2 台盼蓝微观染色方法

将虫卵去壳，取出的幼虫放入PBS液中漂洗2～3 min；再将幼虫解剖，去除幼虫表皮；用0.25%胰蛋白酶置于37℃水浴中消化至幼虫细胞出现间隙；滴加1%台盼蓝染液在室温下浸染2 min；甘油封片，用中性树胶封固压片，最后置于显微镜下观察。

1.2.3 数据分析

用计算机统计软件Origin 7.5对不同辐照剂量下的孵化率进行回归分析，建立数学方程式，得到幼虫孵化率随γ射线照射剂量的变化规律数学模型。

2 结果与分析

2.1 幼虫孵化率宏观试验结果

由表1可以看出，经过γ射线照射的试验组比标准组孵化率低，随着照射剂量的增加，幼虫孵化率呈明显下降趋势。γ1组幼虫孵化率变化不大，幼虫孵化率也比标准组低14.25%，当辐照剂量为300 Gy时，孵化率降至为16.50%，比标准组降低近70%，当辐照剂量为500 Gy时，孵化率已经低于5%，当辐照剂量为700 Gy时，孵化率降至1%，几乎没有虫卵孵化出来，可使虫卵全部致死。从表1还可以看出，舞毒蛾虫卵的孵化率受γ射线剂量影响很大，当辐照剂量低于300 Gy时，孵化率变化明显，孵化率急剧下降，辐照生物效应显著。

表1 幼虫孵化率宏观试验结果Table 1 Macroscopic experiment results of the larva's hatching rate

2.2 孵化率变化规律的数据分析

用计算机统计软件origin 7.5对不同辐照剂量下的孵化率进行回归分析,结果辐照剂量和孵化率的关系符合多项式的五次方曲线方程。其方程中，Gy：辐照剂量；an：参数；f：不同辐照剂量下虫卵孵化率的函数。其方程如下，参数为a0=86.5，a1=0.07832，a2=-0.0031，a3=0.00001，a4=-1.248×10-8，a5=5.3373×10-12。

幼虫孵化率随γ射线照射剂量的变化规律回归曲线如图1所示。

图1 幼虫孵化率随γ射线照射剂量的变化规律Fig.1 Change regulation of larva's hatching rate with γ-ray irradiation dose

2.3 台盼蓝染色的微观试验结果

台盼蓝染色幼虫细胞的微观试验结果如彩版Ⅰ所示，标准组（未辐照）的幼虫细胞均未着色，γ 1组（100 Gy）的幼虫细胞有小部分呈蓝色，γ2组（300 Gy）的幼虫细胞有大部分明显呈蓝色，γ3组（400 Gy）、γ4组（500 Gy）、γ5组（700 Gy）的幼虫细胞几乎全部呈蓝色。台盼蓝染液使幼虫死细胞着色，能鉴别出幼虫细胞的死活状态。由此可知，当辐照剂量为100 Gy时，幼虫体内细胞所受损伤较轻；当辐照剂量大于300 Gy时，幼虫体内死细胞比例迅速上升，活细胞比例极小，而此时幼虫的死亡率也在80%以上，进一步证明细胞存活率与γ射线辐照剂量存在剂量关系，这与宏观孵化率的试验所得结论吻合良好。当细胞损伤或死亡时，台盼蓝染料可穿透变性的细胞膜，与解体的DNA结合，使其着色。而活细胞能阻止台盼蓝染料进入细胞内，借此可以鉴别死细胞与活细胞，从实验结果中可以看到γ射线辐照造成了虫卵细胞损伤或死亡，可见，利用台盼蓝染色可以检测γ射线辐照剂量对虫卵细胞活性影响[12]。

3 讨论与结论

γ射线辐照剂量对虫卵孵化率、染色体损伤程度、细胞存活率都有很大影响，随着γ射线辐照剂量的增加，幼虫孵化率逐渐降低，幼虫细胞的死亡数量逐渐上升；总体上看，宏观试验和微观试验所得结论吻合良好；当γ射线辐照剂量超过300 Gy时，幼虫孵化率变化最为明显，幼虫细胞也几乎全部染上蓝色，辐照生物效应显著。当辐照剂量在300～400 Gy时，既可以在保证灭虫效果，又可以降低辐照防护难度。台盼蓝染色是一种简单、有效、实用的方法，可以利用台盼蓝染色检验物理灭虫的生物学效应，把物理灭虫宏观效果和微观细胞染色有机结合起来，为检验物理灭虫提供新的方法。

由于受到试验仪器条件和舞毒蛾生长周期（一年一代）等方面的限制，本文只对γ射线对舞毒蛾虫卵处理效果试验研究，从幼虫孵化率的宏观变化情况和经过台盼蓝活体染色后幼虫细胞的微观变化情况来阐述物理灭虫的效果。为了探讨电磁辐射对舞毒蛾生长发育的影响，需要从电磁波理论角度研究各种电磁波与生物体的相互作用，及辐照后生物体产生的物理效应、化学效应、生物效应等揭示辐照灭虫的机理。还需要对微波，X射线，紫外线，红外线，超声波，重离子射线等其他物理灭虫手段进行深入研究，将照射后的舞毒蛾虫卵进行人工培育和饲养，直到羽化为成虫。宏观方向探讨射线辐照对虫卵的孵化，幼虫的死亡，化蛹，羽化等各阶段的影响，微观方向可以利用荧光探针技术从微观角度研究辐照虫卵细胞变化情况，构成细胞的主要细胞器，如细胞核等与正常昆虫的差别，以及辐照害虫体内DNA、RNA损伤情况，将物理灭虫方法和荧光探针检测技术结合起来，使荧光探针技术能够应用在物理灭虫效果的微观检测中。物理灭虫在目前科学领域是一个有待发展、又有广阔前景的研究领域，可以弥补传统的化学灭虫的缺陷，为病虫害防治开辟新的渠道[13-15]。

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