7种中药成分对新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞能力的影响

邢玉娟,陈玉库,胡元亮,王德云,郭振环,蔡丙严

(1.江苏畜牧兽医职业技术学院,江苏 泰州 225300;2.南京农业大学中兽医学研究室,江苏 南京 210095)

为了研究抗病毒的新型中药成分复方制剂,首先要筛选主药。本试验以新城疫病毒(NDV)为研究对象,在测定氧化苦参碱(oxymatrine,OM)、甘草酸(glycyrrhizic acid,GA)、绿原酸(chlorogenic acid,CA)、栀子苷(geniposide,GP)、虎杖苷(polydatin,PD)、木犀草素(luteolin,LT)、黄芪多糖(astragalus polysaccharide,APS)等7种中药成分对鸡胚成纤维细胞(chickembryo fibroblast,CEF)生长均呈现促进作用的基础上[1],选取安全浓度范围内的高、中、低3种浓度,分别与NDV以3种方式加入到培养24 h已长成单层的CEF中,测定它们对NDV感染细胞能力的影响,为研制抗NDV的中药成分复方提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 中药成分 GA、CA、LT购自南京青泽医药科技开发有限公司,含量分别为98.03%、98.4%、98.03%;GP、PD购自中国生物制品检定所,含量均为99.0%;OM购自西安富捷生物技术发展公司,含量为98.8%;APS购自南通四海植物精华有限公司,含量为91.9%。根据药物对CEF安全浓度测定结果,将OM 、GA 、CA 、LT、GP、PD 和 APS分别用细胞维持液稀释成以下浓度(μg/m L):PD为500、250、125;GA 为 250、125、62.5;APS 和 CA 为125、62.5、31.25;OM 和 GP 为 32、16、8;LT 为1.6、0.8、0.4,常规消毒后备用。

1.2 病毒 新城疫病毒(NDV)F48 E8株,由中国农业科学院上海兽医研究所惠赠。将病毒按常规方法接种9日龄SPF鸡胚(购自中牧股份南京药械厂),恒温培养72 h,收获尿囊液,按Reed-Muench法[2]测定CEF半数组织培养感染剂量(TCID50),用细胞维持液配成100 TCID50浓度备用。

1.3 主要试剂和仪器 MEM细胞培养液,Gibco公司产品,按说明书配制,再加入犊牛血清,达5%为细胞生长液、2%为细胞维持液,再按常规量加入谷胺酞氨和双抗;胰蛋白酶,进口分装,用PBS(pH值7.4)配制成0.25%溶液,0.22μm混合纤维素酯微孔滤膜过滤除菌,分装后-20℃保存备用;M TT(四唑溴盐)溶液,Sigma公司产品,按说明书配制,使终浓度为 5 mg/m L,0.22μm微孔滤膜过滤除菌,分装后4℃冰箱保存,1周内用完。

MCO-15AC型CO2培养箱,XDS-1B型生物倒置显微镜,DG-5031型酶联免疫检测仪,FA-2004N型电子分析天平,MH-1型微量振荡器,24孔、96孔细胞培养板,细胞培养瓶等。

1.4 试验方法 根据文献[2]介绍的方法制备CEF,将细胞数调整至1×106个/mL后加入到96孔细胞培养板中,每孔100μL,37℃、5%CO2条件下培养24 h,细胞长成均匀单层后,翻转细胞板于灭菌纱布上倾去生长液,用 D-Hank′s液洗两次,按以下3种方式[3]开始分组加药。

1.4.1 先加中药后接种病毒 将高、中、低3种浓度的中药成分加入到CEF单层中,每个中药浓度重复4孔,每孔100μL,继续培养24 h后取出,加中药的各孔再加入100 TCID50的病毒液,每孔100μL。每个稀释度分别设中药对照(中药100μL,细胞维持液100μL)、病毒对照(接种病毒100μL,细胞维持液100μL)和细胞对照(只加0.2 mL细胞维持液)各4孔。继续培养,每组以加入病毒液后开始计算时间,每隔12 h观察1次CPE变化,详细记录结果,直至细胞对照组出现典型的CPE病变后为纪录终点,用M TT法[4]测定570 nm 处 A570值。

1.4.2 先接种病毒后加中药 将100 TCID50的病毒液加入到CEF中,每孔100μL,每个稀释度重复4孔;同时设中药对照、病毒对照和细胞对照。37℃、5%CO2培养箱中培养2 h后取出,然后加入高、中、低3种浓度的中药成分,每孔100μL。以下方法同1.4.1。

1.4.3 病毒和中药同时加入 先将100 TCID50的病毒液加入到CEF中,每孔100μL,每个浓度重复6孔,紧接加入高、中、低3种浓度的中药成分,每孔100μL。同时设中药对照、病毒对照和细胞对照。以下方法同1.4.1。此外,设仅加维持液的无细胞孔作为测定时调零孔。

1.5 数据处理 计算4孔平均值和标准差,数据以Means±SD表示,用SPSS统计分析软件进行方差分析和多重比较。比较中药-病毒组与病毒对照组和中药-病毒组与同浓度中药组之间的A570值差异性,判定中药的抗病毒活性强弱。

2 结果

2.1 OM组的变化 先加中药、后加病毒,16μg/m L和32μg/mL浓度 A570值显著高于病毒对照组(P＜0.05),显著高于和高于细胞对照组;先加病毒、后加中药,32μg/m L和16μg/m L浓度 A570值显著高于病毒对照组(P＜0.05);中药与病毒同时加,16μg/m L和32μg/m L浓度 A570值均显著高于病毒对照组(P＜0.05)(表1)。

表1 OM在先加、后加和与病毒同时加入时各组细胞A570值

2.2 APS组的变化 先加中药、后加病毒时,62.5 μg/m L和125μg/mL浓度组的A570值显著高于病毒对照组(P＜0.05)。62.5μg/m L浓度组的 A570值高于细胞对照组;先加病毒、后加中药时,31.25 μg/m L和62.5μg/mL浓度组A570值显著高于病毒对照组(P＜0.05);与病毒同时加,125、62.5、31.25 μg/m L浓度 A570值显著高于病毒对照组(P＜0.05)。31.25μg/m L A570值高于细胞对照组(表2)。

2.3 GP组的变化 先加中药、后加病毒,32μg/m L浓度 A570值显著高于病毒对照组(P＜0.05);先加病毒、后加中药,32μg/m L浓度 A570值高于病毒对照组,但不显著,中、低浓度的 A570值低于病毒对照组;中药与病毒同时加,32μg/m L和8μg/m L浓度组的 A570值稍高于病毒对照组(表3)。

表2 APS在先加、后加和与病毒同时加入时各组细胞 A570值

表3 GP在先加、后加和与病毒同时加入时各组细胞A570值

2.4 GA组的变化 先加中药、后加病毒,250μg/mL和125μg/mL浓度A570值显著高于病毒对照组(P＜0.05);先加病毒、后加中药,只有 125μg/m L浓度A570值高于病毒对照组,但不显著;与病毒同时加,250μg/mL浓度 A570值显著高于病毒对照组(P＜0.05)(表4)。

表4 GA在先加、后加和与病毒同时加入时各组细胞A570值

2.5 CA、PD和LT组的变化 CA、PD和 LT 3种中药成分无论是哪种加药方式均无抑制病毒感染细胞能力的作用。

3 讨论

3.1 中药成分对NDV感染CEF能力的影响 本试验结果表明,在先加中药、后加病毒时,OM在高、中浓度,GA在高、中浓度,A PS在高、中浓度,GP在高浓度时具有显著的抑制病毒感染细胞能力的作用;先加病毒、后加中药时,OM 高、中浓度,APS中、低浓度有显著的抑制病毒生长作用;中药与病毒同时加入时,OM 高、中浓度,A PS高、中、低浓度,GA高浓度有显著抑制病毒感染细胞能力的作用。综合以上结果,4种中药成分抑制病毒感染细胞能力的作用依次为:OM＞APS＞GA＞GP。而CA、PD和LT 3种中药成分无论是哪种加药方式均无抑制NDV增殖作用。

3.2 中药成分抑制病毒感染细胞能力的量效关系 试验中发现,中药先于病毒加入时,OM、APS、GA在高、中浓度,G P在高浓度对病毒生长有抑制作用;在后于病毒加入时,OM 在高、中浓度、APS在中、低浓度有抑制病毒生长作用;在与病毒同时加入时,OM在高、中浓度,GA在高浓度,APS在高、中、低浓度对病毒生长有抑制作用。说明中药成分必须有合适的剂量才能发挥最佳效应,很多研究都证明了这一结论[5-7]。

3.3 关于中药成分抑制NDV感染细胞能力的作用机制 本试验中,4个中药成分在先于病毒加入时抑制作用最强,在与病毒同时加时也起到了很显著的抑制作用,表明中药成分或通过改变细胞膜表面的病毒吸附蛋白受体,或作用于细胞内而提高其抵抗力,阻止病毒侵入细胞而发挥预防作用,或通过直接灭活病毒来保护细胞[8-9];先接种病毒后加中药,OM和APS高、中、低浓度,GP高浓度,GA中浓度均有一定的抑制作用,表明中药成分特别是OM和APS在病毒感染细胞后也可发挥抗感染能力,从而起到治疗作用。

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