HPLC法测定窈窕茶中大黄酚的含量

周 欣 钟兆健 宋粉云

（广东药学院，广东 广州 510006）

窈窕茶为香港注册的中药成方制剂，由厚朴、陈皮、决明子等十味中药制成，具有通便散热结、利水消肿、理气健脾的功效。临床主要用于治疗因肠胃积热、水湿内停导致肢体沉重浮肿，大便秘结、腹胀、腹痛，口干口燥，小便不利等症状。决明子为窈窕茶的药味之一，其主要有效成分为大黄酚，为此建立了窈窕茶中大黄酚含量测定的反相高效液相色谱法，具有分离效果好、灵敏、准确等优点，可控制其质量。

1 仪器与试药

SHIMADU LC-10Avp（日本岛津公司高效液相色谱仪）；SHIMADU SPD-10Avp（日本岛津公司紫外检测器）；SHIMADU SIL-20A（日本岛津公司自动进样器）；SHIMADU LC-10ASvp（日本岛津公司柱温箱）；LC solution工作站（日本岛津公司）。超声波清洗器KQ5200，频率（35±5）%KHz；功率250W（昆山市超声仪器有限公司）。

窈窕茶（批号：I0509Y、H1201Y、I06620Y，香港北京制药厂提供），规格为2g/包；大黄酚对照品（中国药品生物制品检定所，0796-200205）；甲醇为色谱醇，水为双蒸水，其他化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液的配制

对照品溶液：精密称取大黄酚对照品22.0mg，置100mL量瓶中，加无水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）稀释至刻度，摇匀。精密量取20mL，置100mL量瓶中，加无水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液（大黄酚浓度为44.0μg/mL）。

供试品溶液：取本品装量差异项下的内容物，混匀，取约10g，精密称定，置于150mL具塞锥形瓶中，精密加入甲醇100mL，密塞，称定重量；超声40min；放冷后再称定，用甲醇补足减失重量，摇匀后滤过。精密量取续滤液50mL，蒸干，加10%盐酸溶液30mL，水浴中加热水解1h。冷却后用三氯甲烷振摇提取4次，每次30mL，合并三氯甲烷液，回收溶剂。残渣用无水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）溶解，移至10mL量瓶中，用无水乙醇-乙酸乙酯（2∶1）稀释至刻度，摇匀，用0.45µm微孔滤膜过滤，作为供试品溶液。

阴性对照溶液：取处方组成中除决明子外的其余成分制成阴性对照，按供试品溶液制备方法处理得阴性对照溶液。

2.2 色谱条件及系统适应性试验

色谱柱：DiamonsidTM-C18色谱柱柱（250mm×4.6mm，5µm，迪马公司），流动相：甲醇-0.2%磷酸溶液（90∶10）；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm；柱温：40℃。分别吸取大黄酚对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μL注入色谱仪；理论塔板数以大黄酚峰计算应不低于3000，大黄酚拖尾因子1.10，保留时间约为13min，且大黄酚与相邻组分峰达到基线分离，阴性样品对大黄酚测定无干扰；结果见图1。

图1 大黄酚对照品、样品及阴性的高效液相色谱图

2.3 标准曲线制备

精密量取上述大黄酚对照品溶液分别用无水乙醇-乙酸乙酯（体积比2∶1）制成大黄酚浓度为17.6、22.0、26.4、30.8、35.2、39.6、44.0μg/mL的溶液。依次进样10µL，每个浓度测定3次以上；以峰面积（A）对对照品溶液系列浓度（C）进行回归分析，得大黄酚回归方程：A=47005C-6667.6，相关系数r=0.9996；结果表明大黄酚在17.6～44.0μg/mL范围内线性关系良好。

2.4 精密度试验

精密吸取浓度为30.8μg/mL的大黄酚对照品溶液10μL重复进样5次，测定峰面积的RSD为0.41%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取供试品溶液（批号I0509Y）在0、2、4、6、8、12h分别进样10μL，记录峰面积，结果大黄酚峰面积的RSD=1.63%，表明供试品溶液在12h内稳定。

2.6 重复性试验

精密称取同一批号（批号I0509Y）样品6份，按“2.1”项下供试品溶液制备方法制备。依法测定大黄酚的平均含量为0.062mg/g，RSD值为0.91%（n=6），表明分析方法精密度良好。

2.7 加样回收试验

精密称取窈窕茶样品（批号I0509Y）共6份，每份5g，分别加入相应量的大黄酚对照品，按供试品溶液的制备方法处理并依法测定并计算回收率。测得大黄酚平均回收率为97.6%（n=6），RSD=2.10%；结果见表1。

表1 大黄酚回收率试验结果（n=6）

2.8 样品的测定

分别称取窈窕茶样品3批（批号：I0509Y、I0602Y 、H1201Y），平均装量依次为：2.29g、2.24g和2.24g，每批3份，按“2.1”项下供试品溶液制备方法制备，记录峰面积，代入回归方程计算样品中大黄酚的含量；结果见表2。

表2 样品测定结果

3 讨 论

3.1 样品提取中常规采用加热回流的方式[1]，实验中通过与超声提取方法进行比较后发现超声亦能达到提取的目的，并且简化了实验操作也缩短了时间，经过摸索，最终确定为本文方法，超声40min[2,3]。

3.2 对流动相的选择也进行了选择和比较，由于大黄酚为弱酸性物质，容易解离，因此采用甲醇-磷酸溶液为流动相体系抑制其水解，但是按照药典方法采用0.1%磷酸溶液时发现拖尾因子较大，峰形不对称；在参考文献后，最终确定选用本文中0.2%磷酸溶液为流动相[4-6]，拖尾因子均得到很好的改善，＜1.2，峰形对称性良好；同时在比较流动相配比后，确定甲醇-0.2%磷酸溶液为90∶10时为最佳，大黄酚出峰时间为约13min，并且与样品中其他成分达到了很好的分离。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(2010年版)一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010:135-136.

[2]廖海,周嘉裕,何成生,等.决明子大黄素和大黄酚的提取和含量测定[J].时珍国医国药,2007,18(6):1332-1333.

[3]徐雄良,张志荣,孙逊,等.超声提取法测定熊胆消炎胶囊中大黄素和大黄酚的含量[J].华西药学杂志,2003,18(6):442-444.

[4]张红霞,张磊,朱鲲鹏,等.乌玫茶中决明子质量控制方法的研究[J].武警医学院学报,2008,17(9):765-766.

[5]刘芳,陈建伟.HPLC测定决明子中总大黄酚的含量[J].中成药,2005,27(5):549-551.

[6]王宾豪,杨荣平,张小梅,等.高效液相色谱法测定决明子中蒽醌类成分的含量[J].时珍国医国药,2008,19(1):139-140.