高效液相色谱法测定河车补丸中川续断皂苷Ⅵ的含量

水彩红 曹 红 陈玉敏 胡 丹

（中国人民解放军总后勤部卫生部药品仪器检验所，北京 100071）

河车补丸为国家药典委员会“提高国家药品标准行动计划”品种，该品种原收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》（中药成方制剂）第3册，是由紫河车、人参、续断等十二味中药组成的复方制剂。具有滋肾阴，补元气之功效，临床上用于肾阴不足，元气亏损引起；身体消瘦，精神疲倦，腰酸腿软，自汗盗汗的治疗[1]。其原标准中没有含量测定项，为有效地控制其质量，确保疗效，本文建立了河车补丸中川续断皂苷Ⅵ的液相色谱含量测定方法。该方法简便快速，重现性好，结果准确可靠，能较好的控制其质量。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent-1100高效液相色谱仪，Agilent化学工作站（美国）。KQ-300E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）

1.2 试药

河车补丸（由北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂提供，批号为：60139000、60139001、60139002），规格：每丸重9g；川续断皂苷Ⅵ对照品（111685-200401 供含量测定用）、购于中国药品生物制品检定所；乙腈（色谱纯），水（双重蒸馏水），其他试剂均为分析纯。

2 实验方法与结果[2-4]

2.1 色谱条件

色谱柱Agilent Extend-C18（250mm×4.6mm；5μm）；流动相：乙腈-0.1%磷酸溶液（27∶73）；检测波长为212nm；进样量：10μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取川续断皂苷Ⅵ对照品适量，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1mL含200μg 的溶液，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取重量差异项下的本品，剪碎，混匀，取约2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25mL，称定重量，加热回流60min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 阴性空白对照溶液的制备

按处方比例制备缺续断药材的阴性样品，按供试品溶液的制备方法，制备阴性空白对照溶液。

表1 样品加样回收率试验结果（n=6）

2.5 专属性试验

取阴性空白对照溶液，按上述色谱条件测定，记录色谱图，见图1。结果空白对照溶液在与川续断皂苷Ⅵ对照品相同保留时间处，未显示明显色谱峰，认为无干扰。

图1 HPLC色谱图

2.6 线性关系的考察

精密吸取川续断皂苷Ⅵ对照品溶液（0.938mg/mL ）0.4、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、10.0mL，至10mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，配制成不同浓度的对照品溶液，依次注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定峰面积。以峰面积积分值为纵坐标（Y），川续断皂苷Ⅵ进样量（μg）为横坐标（X），绘制标准曲线，回归方程为：Y=179.76X-1.9298 相关系数r=0.9999（n=7）。结果表明川续断皂苷Ⅵ在0.04256mg～2.1280mg范围内呈良好的线性关系。

2.7 稳定性试验

取重复性试验中的一份供试品溶液，在0、3、5、10、20、24h分别进样10μL，记录峰面积。结果6次进样川续断皂苷Ⅵ峰面积的RSD为0.97%，表明供试品溶液在24h内较稳定。

2.8 重复性试验

取同一批次河车补丸（6013900）样品2g，精密称定，平行6份，按供试品测定法测定，测得川续断皂苷Ⅵ的平均含量为2.188mg/g，RSD为0.52%（n=6）。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的河车补丸（6013900）样品约1g，精密称定，平行6份，按100%比例精确加入川续断皂苷Ⅵ对照品（2.27mg/mL）1mL，按“供试品溶液的制备”项下操作，计算回收率，测得川续断皂苷Ⅵ的平均回收率为100.61%，RSD为0.97%，结果见表1。

2.10 样品测定

精密吸取川续断皂苷Ⅵ对照品溶液、供试品溶液各10μL，按上述色谱条件测定，以外标法计算样品中川续断皂苷Ⅵ的含量，共测定3批样品，结果见表2。

表2 样品测定结果（n=2）

3 讨 论[5,6]

3.1 流动相的选择

分别采用甲醇-水（35∶65），乙腈-0.1%磷酸溶液（27∶73），乙腈-0.1%磷酸溶液（30∶70）等系统为流动相。结果表明以乙腈-0.1%磷酸溶液（27∶73）为流动相，样品中其他色谱峰与川续断皂苷Ⅵ峰分离效果好。

3.2 检测波长的选择

在实验中，对川续断皂苷Ⅵ对照品溶液在200～400nm波长范围内进行光谱扫描，结果表明川续断皂苷Ⅵ在212nm处呈最大吸收值，灵敏度最高，故选择其为测定波长。

3.3 色谱柱的选择

选用了三种色谱柱进行比较：Agilent Extend-C18（250mm×4.6mm；5μm）、Agilent ZORBAX SB-C18（4.6mm×250mm，5μm）、Kromasil C18（4.6mm×250mm，5μm），结果本法最终选择了Agilent Extend-C18（250mm×4.6mm；5μm）色谱柱作为方法学的考察用色谱柱，可使川续断皂苷Ⅵ达到基线分离。

3.4 含量测定项下供试品溶液提取溶媒的选择

分别采用了甲醇、70%甲醇、乙醇、70%乙醇作为提取溶媒进行比较，结果显示甲醇提取较完全，选择甲醇作为测定续断中川续断皂苷Ⅵ的提取溶剂。

3.5 供试品溶液提取方法的选择

分别采用超声处理20min、30min、60min，加热回流30min、60min、90min，进行测定。以加热回流60min川续断皂苷Ⅵ基本提取完全，选择加热回流60min的提取方法。

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[M].北京:中国医药科技出版社,2010:309.

[2]陈海飞,孙艳.HPLC法测定愈骨疗伤胶囊中川续断皂苷Ⅵ的含量[J].中国现代应用药学,2010,27(1):57-58.

[3]马新飞.HPLC法测定不同续断炮制品中川续断皂苷Ⅵ[J].中草药,2007,38(5):707-708.

[4]董文桑.HPLC法测定舒筋活络酒中川续断皂苷Ⅵ的含量[J].中国药师,2008,11(3):284-286.

[5]谭洪根.高效液相色谱法测定续断药材中川续断皂苷Ⅵ的含量[J].中国中药杂志,2006,31(9):726-727.

[6]庞小雄,梁松庆,钟兆健,等.HPLC法测定拈痛丸中川续断皂苷Ⅵ的含量[J].中药材,2007,30(6):734-735.