8种中药对灵芝子实体成分的作用*

张志才，陈明霞，李 欣，申王莉

（江苏大学食品与生物工程学院，江苏 镇江 212013）

灵芝 （Ganoderma lucidum）是一种珍贵的药 （食）用真菌，具有较高的药用价值。近年来，药用真菌与中药结合发酵已经成为开发药用资源的一种非常有效的途径。一方面中药中的某些成分可以促进灵芝自身某些活性成分的产生或者增强；另一方面灵芝也可以利用中药的一些活性成分转化成自身有效成分[1－3]。目前针对添加中药对灵芝液体深层发酵的研究报道很多，添加中药的方法主要有3种：按照一定的比例添加中药粉末[3－6]，研究发现一些中药对菌丝体生物量、胞外多糖含量及灵芝酸含量有一定促进作用；在液体发酵培养基中加入一定量中药水提取液[7－11]，同添加中药粉末的作用类似，另外还发现添加中药水提取液菌丝体体外清除自由基活性有一定增强；添加中药有机化学试剂提取液，有报导加入一定量薏苡仁油可促进灵芝菌丝体的生长及胞外多糖的生产[12]。这些试验结果证明某些中药可以增加灵芝液体培养的生物量、胞外多糖、灵芝酸的含量[3－12]。而中药对固体栽培子实体成分影响的报道少有报道。尽管椴木栽培的灵芝干燥后灵芝质地厚实、坚硬、营养及药效成分齐全，但是其操作复杂、成本高、生长周期长，不利用大规模开发利用[13]。因此本课题探讨添加中药对灵芝子实体固体栽培下子实体成分的变化，目的是获得药理作用良好、人工栽培期短暂的灵芝子实体，为更好的发挥灵芝子实体辅助治疗的效果奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂

赤芝菌种，南通安惠生物科技有限公司惠赠；中药（干姜、青蒿、黄连、苦参、槐米花、何首乌、葛根、山药），购于镇江存仁堂医药连锁有限责任公司梦溪药店；芦丁、齐墩果酸、人参皂甙Rb1均为生化试剂，购于南京替斯艾么中药研究所；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 培养方法

斜面种子菌：制作PDA培养基，在无菌操作环境下，斜面种子菌每6个月转接1次，以保持菌种活力。

灵芝原种制作：麦麸与水按照1∶1比例混匀，按照每瓶35 g上述混合培养基分装到250 mL三角瓶，利用棉塞封口，pH自然，然后在1.0 kPa压力灭菌1 h，冷却至室温，在无菌操作环境下，接入灵芝试管斜面菌种，于30℃培养2.5 d。

灵芝液体发酵：去皮土豆600 g切成小块，加入水3000 mL，煮沸30 min，利用两层纱布过滤并取清液，加入60 g葡萄糖，定容至3000 mL。按照每瓶100 mL上述液体培养基分装到250 mL三角瓶，在1.0 kPa压力灭菌30 min，冷却至室温，在无菌操作环境下，接入灵芝原种，30℃下培养4 d，作为菌种。在以上100 mL培养基基础上，分别按照2‰、5‰、8‰添加中药，以不添加中药作为对照，于1.0 kPa压力灭菌30 min，冷却到室温后，在无菌操作环境下，接入液体摇瓶菌种，30℃下培养7 d。用2层纱布过滤发酵液，取菌丝球于80℃烘箱中烘干至恒重。根据此处菌丝球生物量高低确定灵芝子实体栽培中添加中药的比重。

灵芝栽培管理：麦草粉、麦麸和水按照4∶1∶10的比例混匀，分成9组，每组6瓶，分别添加2‰生姜、青蒿、黄连，5‰苦参、槐米花，8‰何首乌、葛根、山药，以不添加中药作为对照，按照每瓶105 g分装到500 mL三角瓶，料面中央钻1个直径1 cm～2 cm的孔，孔深至瓶底，擦干静瓶口，棉塞封口，用2层报纸包封瓶头，1.0 kPa压力灭菌1 h，冷却至室温。在无菌操作环境下，接入灵芝原种，然后在30℃下培养30 d。待菌丝长满瓶，将三角瓶移入栽培室，直接放置于地面，控制空气湿度在80%～90%。当瓶内灵芝子实体长至棉塞时，拔掉棉塞，让子实体顺利生长。整个生长阶段控制光照强度为100 lx左右。当子实体长至直径5 cm～7 cm时采集子实体，并于80℃烘箱中烘干至恒重，备用。

1.3 子实体成分提取

将赤芝子实体6个重复样分别用粉碎机粉碎，取1 g粉碎粉末加入10 mL无水乙醇，置于25 mL试管，用保鲜膜封口并于80℃水浴提取6 h，上清液经无水乙醇稀释5倍并在4℃冰柜中冷藏用于分析总黄酮、总灵芝三帖和总皂甙的含量；残渣用10 mL水于80℃水浴提取6 h，取上清液，用于分析灵芝多糖的含量。

1.4 成分分析

1.4.1 多糖测定

采用苯酚硫酸法并作修改[14]。

1.4.2 黄酮测定

亚硝酸钠－硝酸铝法[15]。

1.4.3 三萜类测定

取1.3中无水乙醇上清液试样1 mL，加入1 mL盐酸密封于沸水浴水解6 h。采用王翔飞等描述的方法测定[16]。

1.4.4 皂甙测定

采用Pan Shu－yi描述的方法测定[17]，并加以修改。精密称取上述人参皂甙标准溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分别置于试管中，各加无水乙醇至1 mL，加入质量分数5%的香草醛冰乙酸溶液0.2 mL和0.8 mL高氯酸，于60℃水浴15 min，流动水冷却，再加入3 mL冰乙酸，摇匀后置于室温，在570 nm处测定吸光度值，并制作空白液作空白对照。以浓度－吸光度值做标准曲线。试样测定方法取1 ml.3中无水乙醇上清稀释液，依次加入上述试剂，并570 nm测定吸光度、计算含量。

2 结果与讨论

2.1 液体发酵生物量

灵芝液体发酵菌丝体生物量情况见表1。

表1 灵芝液体发酵菌丝体生物量

根据表1中菌丝球生物量，并且相互之间生物量差距不超过 0.2 g·100－1·mL－1， 以高剂量为依据确定几种中药的添加量，2‰干姜、青蒿、黄连，5‰苦参、槐米花，8‰何首乌、葛根、山药。

2.2 成分分析

2.2.1 黄酮含量

许多文献报道真菌在液体培养时具有富集转化中药的活性成分的功能，实验首先考察了灵芝子实体是否具有这方面的功能。在选用的药材中都含有黄酮，但是不同的中药材黄酮的含量不同，而未见灵芝的子实体含有黄酮的报道，因此试验首先以黄酮为指标考察了灵芝子实体富集植物中的活性成分的能力，结果见图1。

图1 灵芝子实体中黄酮含量

图1显示添加中药的灵芝子实体中都含有黄酮，而未添加中药灵芝子实体 （对照）的未检出黄酮，与对照相比，添加中药后，灵芝子实体中黄酮含量显著增加 （p＜0.05）。其中添加葛根、苦参和干姜培养的子实体中黄酮含量最高，同时添加其余几种中药的黄酮含量较低，说明灵芝具有富集植物中活性成分能力，尽管槐米花中黄酮含量比葛根、苦参和干姜高，但灵芝对槐米花中黄酮富集能力较差，说明灵芝对同一类成分不同组分富集能力不同。

2.2.2 多糖含量

多糖是灵芝的主要活性成分之一，大量文献报道灵芝液体发酵菌丝体及子实体中含有丰富的多糖，并且在液体深层发酵菌丝中，添加适量一定种类的中药对多糖的富集有一定促进作用，因此试验考察了中药对灵芝子实体多糖含量影响，结果见图2。

图2 灵芝子实体中多糖含量

图2中除葛根在添加8‰的量下对固体栽培子实体中多糖含量没有增强作用。其他7种中药均显著增加了灵芝子实体多糖的含量 （p<0.05），尤其以添加黄连和苦参，子实体多糖含量增加最为明显。该结果说明不同的中药对子实体多糖影响不同。

2.2.3 三萜含量

三萜类化合物是灵芝赤子实体中的另一类主要活性成分三萜类含量如图3中所示。

图3 灵芝子实体中三萜含量

从图3中可以观察到培养基中添加槐米花、苦参、黄连、山药、干姜、葛根6种中药有增加子实体中三萜含量，尤其以槐米花和苦参增加幅度较大。根据统计学分析，与空白组作对比，只有苦参对子实体三萜含量具有显著性影响 （p<0.05）。

2.2.4 皂甙含量

常见的有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖及葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等，常与皂甙元C3位的-OH连接成甙。皂甙可以分为三萜皂甙与甾体皂甙两大类，发酵培养子实体皂甙含量如图4所示。

图4 灵芝子实体中皂甙的含量

由图4可以看出，实验中添加的8种中药均对子实体皂甙成分的富集有促进作用，其中槐米花的促进作用最为明显。同时添加中药发酵子实体中皂甙含量依次为：槐米花＞山药＞干姜＞苦参＞黄连＞葛根＞青蒿＞何首乌，并且差距非常明显。根据统计分析，与对照组比较，表明槐米花、山药、干姜、苦参4种中药对灵芝字体皂甙含量的具有显著的促进作用 （p<0.05）。

2.3 结论

灵芝子实体具有富集植物中活性成分的作用，同时植物中活性成分也有促进灵芝子实体中活性成分合成的作用，灵芝对不同的中药以及同一类化合物不同的组分作用效果不同，同样的不同中药以及同一类中药的不同的组分对灵芝子实体组分作用效果也不同。

添加中药强化子实体有效成分的研究有待进一步深入研究。

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