益智仁挥发油抗帕金森模型小鼠黑质神经元凋亡的作用研究

黄 凌，朱 毅，邝少轶（1.海南医学院药学院药理教研室，海口市 571101；.海南省药品检验所，海口市57016）

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种中老年人常见的神经系统变性疾病，主要病理改变是中脑黑质致密部（SNc）多巴胺（DA）能神经元选择性地死亡、缺失，致纹状体DA不足，从而导致基底节神经调节功能的紊乱，在临床上表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势不稳等。目前PD的病因尚未清楚，一般认为是由遗传、年龄、环境、氧化应激免疫异常、兴奋性氨基酸毒性、线粒体功能障碍等多种因素所致的中脑SNc DA能神经元死亡，而细胞凋亡是这种细胞死亡的主要方式。因此，对神经元的保护和抗细胞凋亡的治疗已成为PD治疗的主要思路之一。

近年来，在动物实验研究中证实益智仁具有良好的脑保护作用，可用于老年性痴呆及其他智能障碍类疾病的治疗，对神经细胞有抗氧化、抗衰老、减轻兴奋性毒性和抗凋亡作用[1，2]。笔者前期实验研究结果表明[3，4]，益智仁的重要化学成分挥发油具有对抗PD模型小鼠行为学改变，减轻氧化应激反应，提高PD模型小鼠抗活性氧的防御能力，并且在减少凋亡起始因子表达的同时促进抗凋亡因子的表达的作用，本研究旨在进一步探讨益智仁挥发油是否具有减轻PD模型小鼠脑内组织和神经元的受损程度，抑制神经细胞凋亡的作用，为寻求具有防治PD作用的天然药物提供理论依据和数据支持。

1 仪器与材料

1.1 仪器

烤箱（佛山市高明温雅精密烤箱有限公司）；BX41型显微镜（日本Olympus公司）。

1.2 试药

干燥益智仁购于海南省万宁县益智（GAP）种植与产业化开发示范基地，经海南省药品检验所中药室鉴定为真品。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（MPTP，美国Sigma公司）；司来吉兰（南京思科药业有限公司，批号：100911）；甲苯氨兰染色剂、兔抗小鼠酪氨酸羟化酶（TH）、半胱氨酸酶-3（Caspase-3）多克隆抗体、链霉亲和素-生物素-酶复合物（SABC）免疫组化试剂盒、TUNEL细胞凋亡试剂盒、DAB显色试剂盒均购于武汉博士德生物工程研究所。

1.3 动物

SPF级C57BL小鼠，10～12周龄，♂，体重24～30 g，由上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供（动物生产许可证号：SCXK（沪）2003-0002）。所购动物普通饮食喂养5 d后开始实验，控制室温为（22±2）℃，湿度为（55±15）%，保持12 h明暗循环，标准饮食。

2 方法

2.1 药物的提取

按2010年版《中国药典》[5]中水蒸气蒸馏法提取益智仁挥发油，将干燥益智仁粉碎为益智仁粉末（80目过筛），m（益智仁）∶m（蒸馏水）＝1∶8，浸泡6 h，蒸馏6～8 h，得益智仁挥发油，提取率为0.4%。气相色谱分析的结果显示，用于本研究的益智仁挥发油质量稳定、可控。给药前，以吐温80作为乳化剂（占乳剂体积0.5%），将益智仁挥发油与蒸馏水按比例制成对应浓度乳剂，用前摇匀。

2.2 分组与给药

实验分为6组，即正常对照、模型、司来吉兰和益智仁挥发油高、中、低剂量（2.5、0.833、0.278m L·kg-1）组。正常对照组：ig生理盐水0.1m L·10 g-1，每天1次，连续12 d。模型组：ig生理盐水0.1 m L·10 g-1，每天1次，连续12 d；自第6天起ip MPTP30mg·kg-1，每天1次，连续7 d。司来吉兰组：ig 司来吉兰10mg·kg-1，每天1次，连续10 d；自第4天起ig司来吉兰0.5 h后ip MPTP30mg·kg-1，连续7 d。益智仁挥发油高、中、低剂量组：分别ig益智仁挥发油乳剂2.5、0.833、0.278m L·kg-1，每天1次，连续12 d；自给予益智仁挥发油第6天起ip MPTP30 mg·kg-1，每天1次，连续7 d。

2.3 尼氏染色法观察尼氏小体表达

切片脱蜡后浸入1%甲苯胺蓝水溶液中50～60℃温箱内浸染20～40m in，蒸馏水洗后95%乙醇迅速分化，无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。阳性细胞胞质呈蓝色块染。

2.4 SABC免疫组化染色法观察TH表达

流程按SABC试剂盒说明书进行，组织经常规4%多聚甲醛固定2周后，再换入含20%蔗糖的0.01mmol·L-1PBS中，待脑组织下沉后，根据鼠脑部图谱SNc位置作连续冠状石蜡切片。采用SABC法进行免疫组化染色。脑片脱蜡至水，枸櫞酸盐缓冲液中热修复，用 0.01mmol·L-1PBS（pH 7.4）振荡漂洗3次，3%H2O2灭活内源性酶，蒸馏水洗3次后滴加BSA封闭液20min，加入兔抗小鼠TH、Caspase-3多克隆抗体（以PBS稀释100倍）4℃孵育过夜；生物素标记的二抗免疫球蛋白G（IgG）血清室温孵育20m in，PBS洗3次；与SABC试液室温下孵育20m in，PBS洗4次；用新配的DAB显色，显微镜下观察适时用蒸馏水终止反应，苏木素轻度复染。贴片，晾干，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察并摄片。每组每只动物选一张脚间核平面切片，每张随机选一侧SNc，每张切片选取部位尽量一致，以显微镜l0倍物镜采集图像，每张免疫组化切片随机选取SNc400倍视野3个，计数TH阳性细胞，拍片。阳性细胞胞浆胞膜着棕色。

2.5 TUNEL染色法检测神经元凋亡

按试剂盒说明书进行，组织经常规4%多聚甲醛固定2周后，再换入含20%蔗糖的0.01mmol·L-1PBS中，待脑组织下沉后，根据鼠脑部图谱SNc位置作连续冠状石蜡切片。切片常规脱蜡入水，新鲜配制3%H2O2，室温处理10m in，标本片加0.01mol·L-1Tris缓冲盐溶液（TBS）1∶200新鲜稀释Proteinase K 37 ℃消化1～15min，0.01mol·L-1TBS洗3次，每次2m in。标本片加标记缓冲液（Labeling Buffer）20μL/片，以保持切片湿润。按每张切片取TdT和DIG-d-UTP各1μL，加入18μL标记缓冲液中，混匀。甩去切片上多余液体后加标记液，20μL/片，37℃标记2min后加封闭液50μL/片，室温30min，甩掉封闭液，不洗。用抗体稀释液1∶100稀释生物素化抗地高辛抗体（取1m L抗体稀释液加生物素化抗地高辛抗体10μL），混匀后50μL/片加至标本片上，37℃反应30min，用抗体稀释液1∶100稀释SABC（取1m L抗体稀释液加SABC 10μL），混匀后50μL/片加至切片，37℃反应30m in，用新配的DAB显色，显微镜下观察适时用蒸馏水终止反应，苏木素轻度复染。贴片，晾干，脱水，二甲苯透明，中性树胶封片，光镜下观察并摄片。

2.6 测定分析

根据图谱对中脑SNc的尼氏小体、TH阳性细胞数和凋亡小体进行计数，每一例在光镜400倍条件下重复观察3张切片，每张切片取不同视野3个计数后取平均数。

2.7 统计学方法

3 结果

3.1 尼氏染色检测结果

尼氏染色神经元细胞呈细胞核淡染，核仁明显，胞浆呈蓝色；尼氏小体为深蓝色颗粒状存在于胞浆中。与正常对照组比较，模型组小鼠DA神经元的光密度及尼氏小体数量明显降低（P＜0.01）；司来吉兰能显著增加单个视野下PD小鼠脑内细胞尼氏小体的光密度（P＜0.01）；与模型组比较，益智仁挥发油高、中剂量组的尼氏小体的光密度显著增加（P＜0.01或P＜0.05）。结果表明，益智仁挥发油可增加PD模型小鼠SNc神经元内尼氏小体的含量，提示益智仁挥发油具有保护PD模型小鼠SNc神经元的作用。尼氏小体阳性表达结果见表1、图1。

表1 尼氏小体阳性表达结果（±s，400×）Tab 1 Resultsof Nissl’s cytoryctesexpression（±s，400×）

表1 尼氏小体阳性表达结果（±s，400×）Tab 1 Resultsof Nissl’s cytoryctesexpression（±s，400×）

与正常对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常对照组模型组益智仁挥发油高剂量组益智仁挥发油中剂量组益智仁挥发油低剂量组司来吉兰组尼氏小体93.5±5.806 49.14±6.20＊71.86±7.10##61.75±9.036#52.57±5.68 80.34±5.17##n 8 8 8 8 8 8

图1 尼氏小体阳性表达结果（甲苯胺蓝，200×）A.正常对照组；B.模型组；C.益智仁挥发油高剂量组；D.益智仁挥发油中剂量组；E.益智仁挥发油低剂量组；F.司来吉兰组Fig 1 Results of Nissl’s cytoryctes expression（toluidine blue，200×）A.normal control group；B.model group；C.Alpinnia oxyphylla high dose group；D.A.oxyphylla medium dose group；E.A.oxyphylla low dose gro-up；F.selegilinegroup

3.2 SABC免疫组化检测结果

TH免疫阳性细胞为棕色，呈椭圆形或锥形，位于胞浆及胞膜，模型组小鼠SNc的TH免疫阳性细胞数量较正常对照组的单个视野下TH阳性细胞数显著减少（P＜0.01），分布稀疏；而益智仁挥发油高、中、低剂量组的TH免疫阳性细胞数量较模型组显著增加（P＜0.01）。结果表明，益智仁挥发油具有对抗MPTP所引起的TH减少的作用。TH免疫组化染色阳性细胞表达结果见表2、图2。

3.3 TUNEL染色检测神经元凋亡结果

SNc神经元细胞凋亡是PD的重要指征之一，正常对照组小鼠神经元TUNEL阳性反应细胞呈棕色，阳性偶见，而模型组小鼠纹状体内TUNEL染色阳性细胞数量显著多于正常对照组，而益智仁挥发油高、中、低剂量组细胞TUNEL染色阳性细胞数量显著低于模型组（P＜0.01或P＜0.05）。结果表明，益智仁挥发油使PD模型小鼠DA神经元凋亡数量显著降低，具有减轻MPTP对DA神经元的损伤作用。TUNEL染色检测细胞凋亡结果见表3、图3。

表2 TH阳性细胞表达结果（±s，400×）Fig 2 Resultsof TH expressio（n±s，400×）

表2 TH阳性细胞表达结果（±s，400×）Fig 2 Resultsof TH expressio（n±s，400×）

与正常对照组比较：＊P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.01

模型组正常对照组模型组益智仁挥发油高剂量组益智仁挥发油中剂量组益智仁挥发油低剂量组司来吉兰组阳性细胞51.5±7.15 10.29±2.69＊31.57±6.13##23.75±4.37#13.57±3.36#40.43±5.07#n 8 8 8 8 8 8

图2 TH阳性细胞表达结果（DAB，400×）A.正常对照组；B.模型组；C.益智仁挥发油高剂量组；D.益智仁挥发油中剂量组；E.益智仁挥发油低剂量组；F.司来吉兰组Fig 2 Resultsof TH expression（DAB，400×）A.normal control group；B.model group；C.A.oxyphylla high dose group；D.A.oxyphylla medium dose group；E.A.oxyphylla low dose group；F.selegilinegroup

表3 TUNEL染色检测神经元凋亡结果（±s，400×）Tab 3 Results of the apoptosis of substantia nigra neurons of TUNEL（±s，400×）

表3 TUNEL染色检测神经元凋亡结果（±s，400×）Tab 3 Results of the apoptosis of substantia nigra neurons of TUNEL（±s，400×）

模型组阳性细胞n正常对照组模型组益智仁挥发油高剂量组益智仁挥发油中剂量组益智仁挥发油低剂量组司来吉兰组12.14±2.85 36.43±4.79＊21.00±3.70##28.38±6.30##30.71±3.49#17.67±3.17##8 8 8 8 8 8

4 讨论

PD是一种老年神经系统退行性疾病，病因和发病机制十分复杂，主要改变包括选择性SNc-纹状体DA能神经元的变性和丧失，纹状体DA含量显著减少，胆碱递质释放过多而引起神经退行性病变，且伴有5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）释放量的改变和DA功能失调[6]。DA是一种抑制性神经介质，当DA含量降至正常的30%，就可能有PD的症状出现。给予MPTP后，模型组小鼠DA含量显著降低，小鼠表现出运动减少、肢体僵硬、步态不稳、反应迟缓等[3，7]，表明运用MPTP可成功复制C57BL小鼠PD模型。

图3 TUNEL染色检测神经元凋亡结果（DAB，400×）Fig 3 Results of the apoptosis of substantia nigra neurons of TUNEL（DAB，400×）A.正常对照组；B.模型组；C.益智仁挥发油高剂量组；D.益智仁挥发油中剂量组；E.益智仁挥发油低剂量组；F.司来吉兰组A.normal control group；B.model group；C.A.oxyphylla high dose group；D.A.oxyphylla medium dose group；E.A.oxyphylla low dose group；F.selegilinegroup

尼氏小体为神经细胞内的噬碱性颗粒，分布于神经原除轴突和轴丘以外的胞浆中，其主要作用是合成蛋白质，尼氏小体常作为判断神经细胞存活的标志，其变化基本能反映SNc DA神经元的情况。本研究中模型组小鼠尼氏小体的表达显著低于正常对照组，而给予益智仁挥发油可以减少由MPTP造成的尼氏小体表达降低的情况，提示益智仁挥发油具有保护DA神经元的作用[8]。

TH是DA合成的限速酶，在DA能神经元中含量丰富，SNc内TH的一场改变无论作为原发还是继发改变，其含量与功能不足都是导致PD一系列临床症状的重要环节，其数量的多寡反映了神经元凋亡的严重程度。MPTP的毒性代谢产物MPP+可以抑制THmRNA的表达，可造成小鼠DA能神经元功能的降低，诱发PD样的行为表现[9]；本研究中，模型组小鼠TH表达显著低于正常对照组，而给予益智仁挥发油可以减轻MPTP的神经毒性作用，减少由MPTP造成的TH表达降低的情况，从而起到对抗MPTP的神经毒性，保护DA能神经元的作用。

以往的许多研究中获得了PD过程中细胞凋亡的证据，如Kingsbury AE等[10]用TUNEL法发现16例病理确认为PD的患者中脑SNc内可见尼氏小体，提示细胞凋亡在DA能神经元损伤过程中可能占有重要地位。本研究中应用TUNEL法检测观察益智仁挥发油对脑内DA能神经元的抗凋亡作用，并从凋亡调控基因的角度探讨其保护机制，结果表明，模型组细胞凋亡程度明显高于正常对照祖，细胞凋亡是MPTP导致SNc DA能神经元损害的主要作用方式之一，而益智仁挥发油高、中、低剂量组细胞凋亡程度显著低于模型组，而高剂量组抑制凋亡的作用优于中、低剂量组，提示益智仁挥发油具有抑制MPTP所诱导的细胞凋亡的作用，并且益智仁挥发油对凋亡的对抗作用可能存在一定量效关系。

以上结果表明，益智仁挥发油能通过对抗MPTP所致的小鼠行为学改变，增强DA合成限速酶TH的表达，减少凋亡因子Caspase-3的表达，从而起到抑制细胞凋亡抗PD的作用。但益智仁挥发油在临床应用时是否能够有效控制和改善PD的病程发展、患者的症状，真正成为PD的治疗药物，仍然需要更深入的研究。

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